关键词: 降钙素基因相关肽;心肌细胞;细胞毒性;细胞培养
摘 要:目的 探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对心肌细胞的毒性作用. 方法 将原代培养成活4d后的大鼠心肌细胞分为4组，A组为对照组，B，C，D3组分别加入CGRP1×10-9 ，1×10-8 和1×10-7 mol・L-1 .实验开始后0.5，1.0，1.5及2.0h评定心肌细胞搏动功能，观察细胞酶、培养液中电解质变化及形态学变化. 结果 B，C，D组各时点搏动频率均较A组各时点加快，D组在2.0h细胞呈部分或无搏动，随剂量递增及作用时间延长，细胞形态学略有变化，但不明显.乳酸脱氢酶，天冬氨酸转氨酶，肌酸激酶和α-羟丁酸脱氢酶释放量、电解质含量及CO2 含量均未见显著改变. 结论 CGRP在低浓度（1×10-9 ，1×10-8 mol・L-1 ）时呈正性变时、变力作用;高浓度（大于1×10-7 mol・L-1 ）时呈现一定的抑制作用.
Abstract:AIM To investigate CGRP cardiotoxicity profile.METHODS Four day-old spontaneously contracting neona-tal primary myocardial cell cultures obtained from2-to3-day old Wistar rats were pided into4groups，group A as control and group B，C，and D treated with CGRP1×10-9 ，1×10-8 and1×10-7 mol・L-1 respectively from0.5to2.0h.The contractility，morphology，cytoplasmic enzyme（LDH，AST，CK and HBD）release content of myocardial cell，the concentration of electrolytes（K+ ，Na+ ，Ca2+ and Cl- ）in the medium and the content of CO2 were measured0.5，1.0，1.5and2.0h following CGRP administration.RESULTS In group B，C and D the beating rates of myocardial cell cul-tures increased compared with group A.The cells showed partly beating or no beating at2.0h in group D，and the changes on morphology were in a concentration and time-de-pendent manner，but were not significant.Cytoplasmic en-zyme（LDH，AST，CK and HBD）release content of myocar-dial cell，the concentration of electrolytes（K+ ，Na+ ，Ca2+ and Cl- ）and the content of CO2 showed no significant changes.CONCLUSION Lower concentrations of CGRP（1×10-9 ，1×10-8 mol・L-1 ）have positive chronotropic and in-otropic effects，while high concentrations of CGRP（&>1×10-7 mol・L-1 ）show some inhibitive action.
0 引言
降钙素基因相关肽（calcium gene-related pep-tide，CGRP）是一种内源性生物活性多肽，对心血管系统的活动具有调节作用.我们用大鼠心肌细胞原代培养法进行体外研究，旨在探讨CGRP对心肌细胞的作用.
1材料和方法
1.1 心肌细胞的制备与培养［1，2］ 取2～3日龄Wistar大鼠，雌雄不拘（由我校实验动物中心提供），无菌条件下摘取心室，用10g・L-1 胰蛋白酶磷酸盐缓冲液（pH7.4）在磁力搅拌（40r・min-1 ）下分散细胞，10min后改用2g・L-1 胰蛋白酶液重复2次，再用0.1g・L-1 胶原酶磷酸盐缓冲液（pH7.4）消化4次，弃去前2次细胞悬液，后5次细胞悬液离心后弃去上清液，将沉淀物合并混悬于10mL DMEM培养基（Gibco，美国）中行细胞计数，以每孔1×106 细胞密度接种于含100mL・L-1 小牛血清DMEM培养基的24孔板培养液中，于37℃CO2 培养箱中培养.
1.2 实验分组与药物处理 培养成活4d后的心肌细胞更换无血清培养液并分成4组，每组12孔.A为对照组，B，C，D组分别加入1×10-9 ，1×10-8 和1×10-7 mol・L-1 的CGRP.每组再分4个亚组，分别于实验开始后0.5，1.0，1.5及2.0h终止反应.
1.3 心肌细胞搏动功能评定［3］ 于倒置显微镜下每孔随机选择3个细胞簇，用细胞搏动正常、部分搏动（SB）、无搏动（NB）及细胞破坏来评定心肌细胞搏动功能.
1.4 细胞形态学观察［3］ 倒置显微镜下观察心肌细胞胞质内空泡、颗粒及细胞膜伪足的变化，终止反应时，用无血清培养液洗涤2次，2.5g・L-1 胰酶消化后，置锥形离心管中200r・min-1 离心10min～20min，沿管壁倒入20g・L-1 戊二醛2mL，固定2.0h后送我校电镜室常规处理、观察.
1.5 心肌细胞酶代谢及培养液电解质测定［3］ 终止反应各时间点，取各亚组培养液离心后，用全自动生化分析仪（GEMSTAR，美国）测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH），天冬氨酸转氨酶（AST），肌酸激酶（CK）和α-羟丁酸脱氢酶（HBD）的活力，并用电解质分析仪（GEMSTAR，美国）测定K+ ，Na+ ，Ca2+ ，Cl- 及CO2 的含量.
统计学处理:以x ±s表示，行t检验和配对t检验. 2 结果
2.1 心肌细胞搏动功能变化 与对照组（A组）相比，B，C，D组各时点搏动频率均明显加快，但随着药物作用时间的延长，D组搏动频率变慢，部分细胞出现部分搏动或无搏动（Tab1）.
表1 CGRP对大鼠培养心肌细胞搏动频率及形态学的影响 略
2.2 心肌细胞形态学变化 A组心肌细胞呈多角型，胞质内颗粒丰富，表面伸出大量微突起，并有较长的伪足与周围细胞相连，B，C组与A组相似，D组早期有空泡形成，颗粒及伪足减少，随作用时间延长及药剂量增加，损伤逐渐加重（Tab1）.透射电镜见A组心肌细胞呈不规则形，常染色体和异染色体分布均匀，心肌结构清楚，线粒体大小基本一致，嵴平行排列（Fig1）.B组细胞与A组细胞相比，变化不大（Fig2）;C组细胞少有空泡，内质网扩张不明显，溶酶体增多不显著（Fig3）;D组细胞大部分心肌细胞变性，空泡化严重，线粒体肿大，内质网高度扩张，溶酶体增多，核有破碎，嵴排列稍有紊乱（Fig4），但各细胞膜均保持完整.
2.3 心肌细胞酶、培养液电解质及CO2 含量变化 各浓度组在各时间点LDH，AST，CK，HBD释放量、电解质浓度及CO2 含量也未见显著变化（P&>0.05）.
3 讨论
离体大鼠及兔心肌灌流显示在1×10-11 mol・L-1 ～1×10-7 mol・L-1 浓度内，CGRP能引起心率加快，心肌收缩力增强，表现为正性变时和变力作用［4］ .我们通过对离体大鼠培养心肌细胞的研究表明，1×10-9 mol・L-1 ，1×10-8 mol・L-1 浓度的CGRP对心肌细胞无毒性作用，且使心肌细胞的搏动频率加快，呈正性变时性和变力性效应;较高浓度1×10-7 mol・L-1 的CGRP作用初期表现为增强作用，但随药物作用时间延长，正性变力作用减弱并伴有形态学轻微改变.提示低浓度（1×10-9 mol・L-1 ，1×10-8 mol・L-1 ）CGRP能改善细胞膜状态，稳定细胞内离子浓度，而高浓度（1×10-7 mol・L-1 ）CGRP相反还可能加重细胞损伤而呈现浓度双相反应，这与文献报道一致.同时，这也与CGRP对心肌细胞脂质过氧化作用的浓度双相反应时间依赖性一致，提示适当剂量和浓度的CGRP对缺血心肌具有细胞保护作用［5-7］ .其机制可能是CGRP增加了跨膜离子内流及肌浆网钙离子释放，使细胞内钙离子浓度增加所致，更进一步的机制还需深入研究探讨.当然，观察时间过长，培养细胞状态总体不佳，也是值得考虑的影响细胞搏动状态的因素.
图1 －图4 略
参考文献
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