作者：王军 徐洪涛 姚兴海 臧益民 唐朝枢
【关键词】 高血压
关键词: 高血压;红细胞;血小板;L-精氨酸
摘 要:目的 探讨原发性高血压（EH）时人体血液系统L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）载体转运功能的改变. 方法 EH患者12例及健康成年人16例，提取血小板（Pt）和红细胞（RBC），分别测定Pt和RBC的L-Arg转运的动力学特征. 结果 EH患者Pt和RBC对3 H-L-Arg转运呈高亲和性载体转运方式，在不同浓度点EH患者的3 H-L-Arg转运率均比对照组明显低下（P&<0.01）.Eadie-Hofstee Plot分析，EH患者Pt L-Arg的最大转运速率（V
max ）为对照组的79%（P&<0.05），而Pt3 H-L-Arg转运的米氏常数值（Km ）无明显差异.RBC的L-Arg转运总能力Y+ 载体转运系统的转运能力明显低于正常组（P&<0.01），而Y+ L载体转运系统的转运能力无明显改变.L-Arg总转运的最大速率与Y+ 载体转运系统的最大速率分别较对照组降低36.8%和42.5%（P&<0.01），各组之间Km 无明显差异. 结论 EH患者Pt和RBC L-Arg载体转运系统存在明显异常.
Keywords:hypertension;erythrocyte;platelet;L-arginine
Abstract:AIM To investigate the changes of L-arginine
（L-Arg）transportation kinetic characteristics in erythrocytes（RBC）and platelets（pt）of patients with essential hyperten-sion（EH）.METHODS 12EH patients were studied with16normotensive people as control.The RBC and Pt were prepared and the transportation of L-Arg was measured by using the method described by Ghigo and Deliconstantins.RESULTS In EH patients，the ability of Pt L-Arg trans-portation was lower than control and Vmax decreased by21%（P&<0.01）.In RBC，Saturable influx of L-Arg was mediated by teh classical cationic amino acid transport system Y+ and Y+ L system with high affinity.Under zero-trans condition，the ability of L-Arg transportation in EH patients was lower than control.The Vmax for total L-Arg transport and via sys-tem Y+ decreased36.8%and42.5%respectively compared with control（P&<0.01）.But Vmax for L-Arg transport via system Y+ L was not affected by EH.There was no obvious difference between the groups.CONCLUSION There might be disturbance of L-Arg transportation in human erythrocytes and platelets of patients with EH.
0 引言
高血压病是人类死亡的重要原因之一，其发病机制仍未完全阐明.高血压时血液系统功能的改变尤其血小板（Pt）与红细胞（RBC）功能的变化及由此而引起的血液动力学指标的异常是其重要并发症.血细胞功能改变在血栓形成和动脉粥样硬化及高血压发病过程中的作用逐渐受到人们的重视.研究［1，2］ 表明Pt与RBC内均存在L-精氨酸（L-Arg）载体转运系统，通过合成的一氧化氮（NO）来调节Pt和RBC的各种生理功能.我们观察了血细胞L-Arg载体转运系统的改变及其动力学特征，以探讨L-Arg载体转运系统在高血压发病学上的意义.
1 材料和方法
1.1 病例选择与分组 原发性高血压（EH）X期患者12（男8，女4）例，平均年龄（48.8±9.2）岁，符合高血压诊断标准，平均收缩压（21.17±2.57）kPa，平均舒张压（13.59±2.24）kPa，平均动脉压（15.01±3.96）kPa.正常对照组16例，平均年龄（46.3±11.5）岁，常规体格检查均正常.检查前2wk停药.L［2，3-3 H］Arginine（19.6×104 ・mol-1 ）购自Amer-sham Co，其余药品均购自Sigma，为分析纯试剂.
1.2 富Pt血浆（PRP）制备 静脉取血，加入38g・L-1 枸橼酸钠抗凝，（血与抗凝剂体积比为9∶1），离心制备PRP，用Hepes液将Pt数调整在20×10 ・L-1 ～25×106 ・L-1 .
1.3 RBC提取［3］ 采用Deliconstantions G的方法并加以改良.晨起抽取肘静脉血，肝素抗凝，在4倍体积的洗涤液（NaCl140，KCl5，D-glucose5，Mops10mmol・L-1 ）中洗涤RBC3次（4℃离心，3000r・min-1 ，10min），弃上清及上方15%的细胞，再洗涤3次，将其悬浮于改良的Hank’s平衡盐溶液中并记数.
1.4 Pt的L┐Arg转运［4］ 测定 按1∶10（V/V）取PRP于不含CaCl2 和葡萄糖的Hepes液中，4℃，2350r・min离心10min，弃上清，重复洗脱1次.用含CaCl2 和葡萄糖的Hepes液将Pt数调整至5×105 ・L-1 .取50μL分别加入不同浓度的3 H-L-Arg，（5，10，20，40，80，100和200μmol・L-1 ）孵育1min，加入终止液（Formal dehyed270，EGTA16，Nacl150mmol・L-1 ）100μL.经0.45μm孔径微孔滤膜抽滤，用Hepes液4mL冲洗3次，滤膜吹干加入闪烁液，在液闪仪上测3 H-L-Arg放射活性，同时设立不加样本的非特异平行对照管，L-Arg的Pt转运为总摄入量与非特异结合之差.以pmol・10-5 Pt表示.
1.5 RBC的L┐Arg转运［5，6］ 将RBC在无底物的条件下37℃孵育3h.用选择性Y+ 阻断剂NEM（N-ethylmaleimide）与RBC悬液在25℃反应15min，停止反应，洗涤后作转运测定用.［3 H］L-Arg转运测定，取RBC悬液1mL（1×105 个细胞）分别加入5μmol・L-1 ～500μmol・L-1 的［3 H］L-Arg，37℃孵育5min，冰上停止反应，用冷的等张溶液洗涤细胞后将细胞溶解后测定细胞悬液的蛋白含量.［3H］L-Arg转运率采用微孔滤膜抽滤法测定.用NEM处理过的RBC的［3 H］L-Arg转运是由Y+ L系统介导的;由Y+ 系统介导的［3 H］L-Arg转运用NEM未处理过的RBC的［3 H］L-Arg总转运率减去Y+ L系统的转运率.
统计学处理:实验结果以x ±s表示，方差分析组间q检验作统计学处理.
2 结果
2.1 EH患者Pt L┐Arg转运动力学指标的变化 EH患者及对照组L-Arg转运的浓度曲线见Fig1. Pt对3 H-L-Arg转运呈高亲和载体转运方式，在不同浓度点EH患者的转运率均比对照组明显低下，P&<0.01.Eadie-Hofstee Plot分析，EH患者Pt L-Arg的最大转运速率（Vmax ）对照组为79%（P&<0.05），而Pt3 H-L-Arg转运的米氏常数值（Km ）无明显差异（P&>0.05）.
图1 略
2.2 EH患者RBC L┐Arg转运动力学的变化 EH患者RBC Y+ 系统和Y+ L系统对L-Arg的转运方式与Pt相似，亦呈高亲和转运方式（Fig2，3）.在不同浓度点EH患者RBC L-Arg的总转运速率和通过Y+ 系统介导的转运速率均明显低于对照组，各点差异均十分显著（P&<0.01）.而由Y+ L系统介导的转运速率在各浓度点均与对照组无明显差异（P&>0.05）.EH患者RBC L-Arg的总转运最大速率Vmax ，Y+ 系统介导的转运最大速率分别较对照组降低36.8%（3.33±0.28vs5.27±0.40，P&<0.01）和42.5%（2.50±0.21vs4.35±0.32，P&<0.01）.而各转运系统L-Arg转运的Km 无明显差异（P&>0.05）.
多数学者认为高血压时血液在血管内呈湍流状态，此时细胞与细胞之间、细胞与血管壁之间相互碰撞，使血小板膜受损，引起ADP释放，从而使血小板黏附与聚集功能大为增加.已有实验证实，血小板通过高亲和性非Na+ 依赖性Y+ 蛋白氨基酸载体转运L-Arg到细胞，在NO合酶的作用下生成NO，NO通过激活鸟苷酸环化酶，使胞质内Ca2+ 下降，从而抑制血小板的黏附与聚集.另有报道高血压时血小板NO合成减少，其减少是否与载体功能有关尚未见报道.
本实验证实高血压时，确存在Pt聚集功能的增强且可能与L-Arg转运功能的降低及NO生成减少有关.故本文提示，在治疗高血压时，除积极降压外，还需考虑与抑制血小板活性的药物及促进血小板L-Arg转运的药物联合应用，对防治动脉粥样硬化和减少并发症可能会有更好的疗效.
图2 － 图3 略
1994年有人用电子自旋共振法（electron spin resonance，ESR）证实了RBC能够合成NO以调节自身的生理功能［5］ .而NO合成的前体L-Arg是由RBC膜上的氨基酸转运载体系统Y+ 系统和Y+ L系统转运入细胞的.RBC自身产生的NO可能参与调节RBC的变形能力、膜渗透脆性，维持细胞膜骨架的稳定，影响RBC的膜渗透脆性，并与血液循环及血压的调节和氧的运输与释放有关［7，8］ .最近资料表明RBC尚有维持血管张力和调节Pt功能的作用，预先用NOS抑制剂处理RBC，则由RBC介导的抑制Pt黏附与聚集的作用会明显降低，提示RBC的这种调节作用至少部分是通过NO来实现的［9］ .疾病时 RBC L-Arg转运功能及NO的生成已有报道.慢性肾衰尿毒症患者RBC L-Arg转运功能明显增加，其中Y+ 系统的转运能力升高明显，而Y+ L系统的功能改变不明显［7］ ，提示Y+ L系统主要参加生理条件的L-Arg转运.而这种改变可能是尿毒症患者的血浆L-Arg较低的一种代偿反应.Dario等
［10］ 发现疟疾患者RBC的NOS活性及NO产生量较正常人明显升高.而在乳腺癌患者由于RBC NOS活性的升高、NO及ONOO- 释放增加，使RBC膜硬度增加，降低了RBC寿命，导致患者出现贫血的并发症［8］ .
关于高血压时RBC L-Arg转运的改变目前尚无报道.由本文结果可见，高血压时RBC L-Arg转运能力明显减低，尤以Y+ 系统与L-Arg转运能力减低有关.
参考文献:
［1］Zicha J，Kunes J，Devynck MA.Platelet calcium handling is dif-ferent in rats with salt-dependent and spontaneoes forms of ge-netic hypertension ［J］.Am J Hypertens，1996;9:812-814.
［2］Mendes AC，Hanssen H，Kiessling K.Transport of L-arg and the nitric oxide inhibitor N
8 -monomethyl L-arg in human ery-throcytes in chronic renal failure ［J］.Clin Sci，1997;93:57-63.
［3］Deliconstantions G，Villiotou V，Stavrides JC.Nitric oxide and peroxynitrite production by human erythrocytes:A causative factor of toxic anemia in breast cancer patients ［J］.Anticancer Res，1995;15:1435-1446.
［4］Ding Ah，Nathan CF，Stuehr DJ.Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritondal macorphages ［J］.J Immunol，1988;141:2407.
［5］Hiroaki K，Satonorl T，Tadashi Y.Direct proof of nitric oxide formation from a nitrovascular metabolised by erythrocytes ［J］.Biochem Biophy Res Com，1994;3:1055-1061.
［6］Deves R，Angelo S，Chavez P.N-Ethylmaleimide discriminates between two lysine transport system in human erythrocyte ［J］.J Physiol，1993;468:753-766.
［7］Mendes AC，Hanssen H，Kiessling K.Transport of L-arg and the nitric oxide inhibitor Hg-monomethyl-L-arg in human ery-throcytes in chronic renal failure ［J］.Clin Sci，1997;93:57-64.
［8］George D，Vassiliki V，John C.Nitric oxide and peroxynitrire production by human erythrocytes:A causative factor of toxic anemia in breast cancer patients ［J］.Anticancer Res，1995;15:1435-1446.
［9］Hadengue AI，Delpiro M，Simon A.Evidence for the presence of L-arginine-nitric oxide pathway in human red blood cells:Rele-vance in the effects of red blood cell on platelet function ［J］.Hypertension，1998;32（2）:324-332.
［10］Dario G，Roberta T，Hagai G.Erythrocyte stage of plasmodium falciparum exhibit a high nitric oxide synthase activity and re-lease a NOS-inducing soluble factor ［J］.J Exp Med，1995;182:677-688.转贴于