作者：周更须 梁延春 张荣庆 贾国良 蔡振杰
【关键词】 心房颤动
关键词: 心房颤动;风湿性心脏病;钙;Fluo-3
摘 要:目的 观察风湿性心脏病（RHD）心房纤颤（AF）患者心房肌细胞内是否存在Ca2+ 超载. 方法 急性分离RHD伴AF和非AF患者的心房肌细胞，用Fluo-3作为钙指示剂，用共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+ 浓度. 结果 AF组心房肌细胞内Ca2+ 浓度明显高于非AF组心房肌细胞内Ca2+ 浓度（517±98）nmol L-1 vs（262±65）nmol L-1 ，两组间差异显著（P&<0.01）. 结论 RHD伴AF患者心房肌细胞内存在Ca2+ 超载.
Keywords:atrial fibrillation;rheumatic heart disease;calci-um;Fluo-3
Abstract:AIM To observe whether Ca2+ overload exists in atrial myocytes of rheumatic heart disease patients with atrial fibrillation.METHODS Atrial myocytes of rheumatic heart disease patients with and without atrial fibrillation were a-cutely isolated.Intracellular Ca2+ concentration was mea-sured with the fluoresent Ca2+ indicator Fluo-3and laser scanning confocal microscopy.RESULTS Intracellular Ca2+ concentration of atrial fibrillation group was significantly higher than that of non-atrial fibrillation group ［（517±98）nmol L-1 vs（262±65）nmol L-1 ）］.CONCLUSION Ca2+ overload exists in atrial myocytes of rheumatic heart disease with atrial fibrillation patients.
0 引言
Wijffels等［1］ 对山羊心房纤颤（atrial fibrilla-tion，AF）模型的研究提示，AF的心房有效不应期缩短，我们［2］ 及Daoud等［3］ 对阵发性AF患者的研究得到了同样的结论，这种心房肌电生理特性改变的现象称为心房肌电重构（atrial electrical remodeling，AER）.该AER在AF的发生及维持中起着十分重要的作用.Dauod等［3］ 和Tielieman等［4］ 的研究还发现，应用钙离子拮抗剂维拉帕米能有效地预防和减轻AER，推测心房肌细胞内钙超载可能是AER的原因.但这一推测尚无直接证据.我们应用激光共聚焦显微镜技术定量测定风湿性心脏病（rheumatic heart disease，RHD）AF患者心房肌细胞内钙离子浓度，检验该类患者心房肌细胞内是否存在钙超载.
1 材料和方法
1.1 试剂和溶液［5］ Tyrode液（mol L-1 ）:NaCl126.0，KCl5.4，MgCl2 0.8，CaCl2 1.0，Nah3 PO
4 0.33，HEPES10.0，Glucose5.5.无钙Tyrode液按Tyrode液配方不加CaCl2 .Fluo-3/Am（美国BIO-RAD）.胶原酶（日本Yakult）.蛋白酶XXIV（美国Sigma）.牛血清白蛋白（美国Amerco）.
1.2 病例及分组 所有病例均为1999-01/1999-05来我院行心脏外科手术的患者.实验组:RHD伴有AF（n=8，男3，女5），平均年龄（44±9）岁.对照组:RHD不伴有AF（n=6，男2，女4），平均年龄（43±10）岁.2组间年龄无显著差异（P&>0.05），2组患者心脏瓣膜病变情况大致相同，均无充血性心力衰竭，均为二尖瓣中-重度狭窄伴中-重度返流并行二尖瓣膜置换手术.实验组AF病程为（13.1±6.4）mo.
1.3 单个人心房肌细胞的分离［6］ 将手术中获得的小块右心耳组织迅速置于预先氧合30min的无Ca2+ Tyrode液中，并于5min内送回实验室.用无Ca2+ Tyrode液清洗组织，然后将组织剪成1mm×1mm×1mm大小碎块，置于含有蛋白酶ⅩⅩⅣ型33.3μmol L-1 ，胶原酶3.33mmol L-1 的无Ca2+ Tyrode液中，于37℃在充氧条件下消化40min，而后将组织块移至含有胶原酶3.33mmol L-1 的无Ca2+ Tyrode液中消化10～20min.将组织块移至含有牛血清白蛋白的无Ca2+ Tyrode液中，吹打，即可获得单个人心房肌细胞.
1.4 人心房肌细胞内钙离子浓度的测定
1.4.1 测定原理［7］ Fluo-3是一敏感性钙指示剂，能特异性与Ca2+ 结合，并在一定波长激光激发下产生荧光，其荧光强度与Ca2+ 浓度成正比，因而可用于Ca2+ 浓度的定量观察.但Fluo-3为极性大的酸性化合物，难以进入细胞膜，而当其结合上亲脂的2-酰羟甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM，在与细胞温育时，很容易透过细胞膜，胞质内的非特异性酯酶将其酯基脱去生成游离的Fluo-3.
1.4.2 Fluo-3/AM的荷载［8］ 采用离心方法（1000r min-1 ，5min）使用Tyrode液（pH7.4）洗涤获得的人心房肌细胞2次，于37℃避光条件下用Fluo-3/Am（4.4μmol L-1 ）荷载.90min后用Tyrode液洗涤细胞3次，洗去细胞外液残余染料，最后保留少许细胞外Tyrode液.
1.4.3 细胞内Ca2+ 浓度的测定［9］ Fluo-3/AM荷载的人心房肌细胞在共聚焦显微镜（MRC-1024，BIO-RAD）下扫描细胞内荧光强度，激发波长488nm，放射波长526nm.应用数字传入式摄像机和高速度计算机处理软件得到清晰的细胞内分布图像.利用其图像量化、分析系统进行图像分析.［Ca2+ ］i 由下面公式得出:［Ca
2+ ］i =kd［（F-Fmin ）/（Fmax -F）］，kd是Fluo-3与Ca2+ 反应解离常数，kd=400nmol L-1 ，F为所测得的荧光强度值，Fmax 和Fmin 分别为Ca2+ 饱和及无Ca2+ 时的胞内荧光强度.每例患者测定3个心房肌细胞，取其平均值作为该患者的心房肌细胞内游离Ca2+ 浓度.
统计学处理:所有数据均用x ±s表示，两组间比较用t检验.
2 结果
对细胞荷载Fluo-3/AM后的细胞内游离Ca2+ 图像观察发现，RHD伴有AF患者的心房肌细胞荧光强度（Fig1）明显强于RHD不伴AF患者心肌细胞的荧光强度（Fig2）.从细胞内游离Ca2+ 定量图分析（Fig3，4），RHD伴有AF患者的心房肌细胞内游离Ca2+ 浓度为（517±98）nmol L-1 ，明显高于RHD不伴有AF患者的心房肌细胞内游离Ca2+ 浓度（262±65）nmol L-1 ，二者差异显著（P&<0.01）.
3 讨论
Ca2+ 作为细胞生命活动中信息传递的第二信使，是维持心肌细胞功能的基础因素，其在细胞内浓度的变化，很大程度上影响着心肌细胞收缩、电兴奋等生理功能的变化.一些证据推测细胞内Ca2+ 超载在AF介导的AER中起作用［3-5］ .Goette等［10］ 利用透射电镜研究发现，快速起搏狗心房几个小时造成的心房组织学改变与Ca2+ 超载所造成的损伤一致.L型Ca2+ 通道阻滞剂维拉帕米能减轻5～10min短阵AF患者所造成的AER［3，4，11］ .尽管存在这些证据，但AF患者心房肌细胞内是否存在Ca2+ 超载尚无直接证据.我们采用RHD伴AF患者的心房肌细胞为实验对象，以RHD不伴AF患者的心房肌细胞为对照，利用激光共聚焦显微镜技术对细胞内Ca2+ 浓度直接测定，结果证实RHD伴AF患者的心房肌细胞内确实存在Ca2+ 超载.
AF导致心房肌细胞内Ca2+ 超载的原因可能为:AF时心房激动频率作用，使得心房肌细胞内Ca2+ 浓度升高;Ausma等［12］ 的研究提示心房肌缺血可能参与导致细胞内Ca2+ 浓度升高.其他如T性Ca2+ 通道Ca2+ 内流增加［13］ 等等因素也可能参与胞内Ca2+ 超载的形成.
参考文献
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