作者：甄海宁 章翔 张志文 黄文晋 张萍 梁景文 刘先珍
【关键词】 SV40
关键词: SV40;大T抗原（Tag）;脑肿瘤;p53;pRb
摘 要:目的 探讨SV40早期区域基因编码产物大T抗原（Tag）的表达及与抑癌蛋白p53，pRb的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义. 方法 采用免疫共沉淀结合银染色及Western印迹法检测65例人脑肿瘤及8例正常人脑组织中Tag的表达，并对18例和15例Tag阳性瘤组织分别检测Tag-p53和Tag-pRb复合物的形成. 结果 SV40Tag在人脑肿瘤中广泛表达，阳性率为66%（43/65），而8例正常人脑组织均无Tag表达，二者差异显著（P&<0.05）;分别检测18例和15例Tag阳性瘤组织，均发现Tag可与p53，pRb形成特异性复合物. 结论 SV40Tag的表达与人脑肿瘤的发生有一定关系;SV40Tag与p53，pRb形成特异性复合物并导致其失活，可能是SV40致人脑肿瘤发生的一个重要机制.
Keywords:simian virus40（SV40）;large tumor antigen（Tag）;brain neoplasms;p53;pRb
Abstract:AIM To study the expression of SV40early re-gion gene coding product，the large tumor antigen（Tag），and its interaction with tumor suppressors p53and pRb in human brain tumorigenesis.METHODS Tag was investi-gated by immunoprecipitation followed by silver staining and Western blot in65cases of human brain tumors and8cases of normal brain tissues.Tag-p53and Tag-pRb complexes were screened by immunoprecipitation and Western blot in18and15Tag positive tumor tissues respectively.RESULTS SV40Tag was expressed generally in human brain tumors with a positive rate66%（43/65），while in8normal brain tissues Tag was negative in all cases.There was a significant difference between them（P&<0.05）.Tag-p53complex was detected in all of18Tag positive tumors，and Tag-pRb com-plex was positive in all of the15Tag positive tumors.CON┐CLUSION SV40Tag expression is associated with human brain tumorigenesis.The inactivation of p53and pRb due to the formation of Tag-p53and Tag-pRb complexes might pos-sibly be an important mechanism in the pathogenesis of hu-man brain tumors.
0 引言
近年有关猴病毒40（simian virus40，SV40）与人脑肿瘤及其他某些类型肿瘤发生的病因学关系，已成为肿瘤学研究的一个新热点.但对于SV40是否存在于人脑肿瘤组织中，以及是否表达癌蛋白大T抗原（Tag）仍无统一认识.已知人体细胞是SV40的半允许细胞，即使SV40确实存在于人脑肿瘤组织中，是否具有致瘤性，以及机制如何，对此国内外均未见报道［1，2］ .我们采用免疫共沉淀结合银染色及Western印迹法，检测了SV40早期区域基因编码产物Tag在人脑肿瘤中的表达，并发现Tag可与抑癌蛋白p53及pRb形成特异性复合物，进一步讨论了SV40与人脑肿瘤发生的病因学关系.
1 材料和方法
1.1 材料 人脑肿瘤65例及正常人脑组织8例新鲜标本均由全军神经外科研究所标本库提供.脑肿瘤按1990年WHO标准分类，包括胶质瘤45例，脑膜瘤和垂体腺瘤各10例.以表达SV40Tag的HFSV40细胞株作为阳性对照.
1.2 方法
1.2.1 免疫共沉淀［3］ 组织标本或培养细胞经裂解处理后，分别用SV40Tag单抗、p53单抗或pRb多抗及A蛋白-sepharose珠沉淀目的蛋白.阴性对照用无关肝癌小鼠腹水代替上述抗体.
1.2.2 银染色［3］ 蛋白样品经100g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，凝胶用新配制的1g L-1 硝酸银溶液染色.
1.2.3 Western印迹 ［3］ 蛋白样品经100g L -1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜.分别用Tag单抗（1 5000）或pRb多抗（1 1000）或同时加入Tag单抗（1 5000）及p53单抗（1 1000）作为第一抗体，用硫酸镍铵加强法DAB显色.
统计学分析:应用美国SPSS7.5统计软件包，采用χ2 检验.
2 结果
2.1 SV40Tag在人脑肿瘤中普遍表达 银染色及Western印迹结果一致，其中胶质瘤阳性率为60%（27/45），脑膜瘤70%（7/10），垂体腺瘤90%（9/10），而8例正常人脑组织均无Tag表达;脑肿瘤SV40Tag总阳性率66%（43/65），与正常脑组织比较差异显著（P&<0.05，Fig1，2）.
图1 － 图2 略
2.2 18例Tag阳性瘤组织 包括胶质瘤12例，垂体腺瘤及脑膜瘤各3例，免疫共沉淀结合Western印迹均显示Tag及p53蛋白带共同存在，表明Tag与p53可形成特异性复合物（Fig3）.
2.3 15例Tag阳性瘤组织 包括胶质瘤11例，垂体腺瘤及脑膜瘤各2例，免疫共沉淀结合Western印迹亦均显示Tag及pRb蛋白带共同存在，表明Tag亦可与pRb形成特异性复合物（Fig4）.
3 讨论
SV40是一种DNA肿瘤病毒，在体外可使人及动物多种组织类型正常细胞发生恶性转化，在啮齿类动物及转基因小鼠体内可诱发多种肿瘤形成［4］ ，但与人肿瘤发生的病因学关系始终未能明确［1，2］ .近年国外学者采用PCR结合Southern印迹杂交发现，在人脑肿瘤组织中存在SV40基因组结构，RT-PCR及免疫组化证实Tag在转录和翻译水平均有表达［5-8］ ，提示SV40与人脑肿瘤的发生有一定关系.由于以往未见有在人肿瘤组织中单纯用Western印迹检测到Tag的成功报道，推测这可能与SV40Tag表达水平较低有关.故本研究结合使用了免疫共沉淀法，意在首先对可能存在的Tag进行“浓缩”，继而用比West-ern印迹灵敏10倍的银染法进行蛋白显色.结果发现在Mr （9～10）×104 之间存在一条显见的蛋白带，提示Tag（Mr 9.4×104 ）的存在.进一步用Western印
迹检测，证实Western印迹与银染色结果一致，SV40 Tag在人脑肿瘤中普遍表达，而正常脑组织中无一表达，二者表达阳性率差异显著.SV40Tag在人脑肿瘤组织中的表达不仅间接证明了SV40基因组的存在，而且其早期区域基因具有转录和翻译的功能，提示SV40与人脑肿瘤发生密切相关.
图4 略
体外实验证实SV40Tag具有多种促细胞恶性转化活性，包括与抑癌蛋白p53，pRb，p107，p130和p400等形成特异性复合物，使其抑癌活性丧失;整合至细胞基因组破坏其正常结构及稳定性;反式激活细胞基因异常表达;具有ATP酶和解旋酶活性，刺激细胞DNA复制等［4］ .SV40Tag在体内的生物学活性研究尚未见报道.本研究发现SV40Tag在人脑肿瘤组织中，仍具有类似于其在体外的与p53，pRb形成特异性复合物的生物学活性，这可能是人脑肿瘤中p53，pRb基因除突变、缺失、甲基化及重排失活外另一种在蛋白水平上的失活方式，而在SV40致人脑肿瘤发生发展中发挥重要作用［9］ .SV40Tag在人脑肿瘤中是否还表现其他致癌活性尚有待进一步研究探讨.
参考文献:
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