【关键词】 结核分枝杆菌
关键词: 结核分枝杆菌;聚合酶链反应;微孔板杂交
0 引言
结核杆菌感染仍是当今世界范围内危害人类健康的严重问题，在发展中国家结核病为一种常见的传染性疾病.目前，结核病的确诊手段主要依据实验室方法进行，其方法有直接涂片染色抗酸杆菌与结核菌的培养与鉴定，但直接涂片染色阳性率低，且不易于确诊，培养法时间长，达不到快速诊断的目的.聚合酶链反应（PCR）技术，作为结核菌的非培养诊断技术，其特异性，敏感性，以及简便快速等优点在临床结核病的快速诊断上得到应用.但是由于受多种因素的影响，使检测结果易出现假阳性及假阴性，给临床确诊带来困难.我们通过设计一对结核菌特异性引物及特异性探针，采用微孔板反向杂交法，对PCR扩增产物进行液相杂交分析，以进一步提高检测结果的特异性和敏感性.
1 材料和方法
引物选自结核分枝杆菌染色体基因，扩增片段长度为:123bp［1］ ，TB1 5’-CCT GCG AGC GTA GGC GTC GG-3’，TB2 5’-CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG-3’，探针 5’-GCC CAG TGC GAC ACA-3’在合成时TB15’端标记生物素，TB25’端标记地高辛.临床标本40份，其中痰液标本30份，脑脊液标本10份分别来自西京医院及323医院.PCR反应液组成:10×PCR缓冲液，4×dNTP，引物，无菌去离子水等.杂交液:聚蔗糖400，0.25g，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.25g，牛DNA0.0625g，BSA0.25g，20×SSC31.25mL，1mol・L-1 HCl375mL，超纯水至1000mL.辣根过氧化物酶标亲合素（临用前用pH7.4PBS1∶150稀释成酶应用液），购自华美生物工程公司.显色液:pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液9.9mL，10g・L-1 TMB0.1mL，300ml・L-1 双氧水10μL.洗涤液:pH7.4PBS终止液:2mol・L-1 硫酸.变性液:0.25mol・L-1 NaOH.痰液标本的模板制备［2］ :取晨痰1mL于无菌试管内，加3g・L-1 胰酶缓冲液1mL，煮沸30min，600g离心5min，取上清液作模板.脑脊液标本模板制备［3］ :取脑脊液100μL，800g离心10min，去上清，沉淀加50μL裂解液，煮沸15min，800g离心5min，取上清液作模板.PCR扩增反应:反应总体积为50μL，10×PCR缓冲液5μL，4×dNTP（200μmol・L-1 ）6μL，引物（0.1μg・μL-1 ）1.0μL，无菌去离子水32μL，模板5μL，Taq DNA聚合酶1U・μL-1 ，以无菌石蜡油30μL覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，32个循环，最后72℃延伸5min.扩增产物15μL，以20g・L-1 琼脂糖（含EB液）上100V电泳30min，于紫外线下观察结果，出现目的扩增带者为阳性，未见目的扩增带为阴性.反向杂交检测:取0.25mol・L-1 NaOH与等量扩增产物混合，室温10min.取25μL变性液与杂交液（内含50mmol・L-1 TB探针）100μL于微孔反应板内37℃60min，洗涤3次，拍干.在微孔反应板内加酶应用液100μL37℃15min，洗涤3次，拍干，加显色液100μL，37℃10min，加终止液100μL，于酶标仪450nm比色.结果判定:先用空白校零点，然后读取各孔吸光度值.样品A值/阴性对照平均A值≥2.1时判断为阳性，阴性对照孔值应在0.05～0.20之间. 2 结果
常规PCR-琼脂糖凝胶电泳法，检测30份痰液中有16份可见123bp的扩增区带，检出率为53.0%;在10份已确诊的结核性脑膜炎患者的脑脊液标本中有9份可见123bp的扩增区带，检出率为90.0%.将PCR扩增产物经变性处理后进行微孔板反向杂交量化分析，阴性对照平均OD值为0.052±0.002，在30份痰液标本扩增产物中有18份吸光度值&>2.1，阳性率占:60%;在10份已确诊的结核性脑膜炎患者的脑脊液标本的吸光度值均&>2.1，阳性率为:100%.
3 讨论
聚合酶链反应技术检测结核菌的方法，在结核病的临床快速诊断上已被广泛采用，方法的灵敏、快速、简便等优点已得到公认.但是由于受多种影响因素的干扰使检测结果 易出现假阳性和假阴性反应，给临床结核病的快速诊断与治疗带来困难.PCR-微孔板反向杂交分析技术是近年来国外发展起来的一种新的基因诊断技术［4，5］ ，其特点是不需要将目的基因固定在滤膜上，而是在液体环境中进行杂交过程，使杂交时间大大缩短，而且操作方法简便，从而极大地提高了检测结果的特异性和可靠性.PCR-微孔板反向杂交分析技术用于检测TB-DNA，微孔板包被有与BSA相连的寡核苷酸，预杂交使捕获探针与微板相连，然后再加入变性后的PCR扩增产物与捕获探针杂交，洗涤后用酶标亲和素与扩增产物5’端标记的生物素反应，最后加入底物显色.用酶标仪比色，测定其孔间的吸光度值，从而达到量化反应.本方法所选用PCR引物及探针均可特异地针对分枝杆菌属中的人型结核菌和牛型结核菌，而且杂交灵敏性比琼脂糖电泳法要高出至少一个数量级［6］ .应用微孔板反向杂交法与电泳法对40份临床标本同时检测，在30份痰液标本中，琼脂糖电泳法阳性16/30，阳性率为:53.0%，PCR-微孔板反向杂交法阳性18/30，阳性率为:60.0%.在10份脑脊液标本中，琼脂糖电泳法阳性9/10，阳性率为:90%，PCR-微孔板反向杂交法阳性10/10，阳性率为:100%.实验结果提示，PCR-微孔板反向杂交法检测结果的敏感性和特异性，以及可靠性上明显优于琼脂糖电泳法检测结果.PCR-微孔板反向杂交法与常规电泳法一样仍需注意防污染问题
［7］ .微孔板杂交法可确定扩增产物的特异性和敏感性，并未能解决样品间的污染所导致的假阳性问题.在采用微孔板杂交法检测结核菌时，除遵循常规PCR防污染的注意事项外，如操作区绝对分开，所用一次性器材高压灭菌，一次性使用，戴一次性手套等.还应注意如微孔板，洗涤液，杂交液应收集并酸化处理.
参考文献
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