作者：吕安林 高歌 贾国良 王小燕
【关键词】 氧
关键词: 氧;动脉平滑肌细胞;冠脉再狭窄
摘 要:目的 探讨缺氧和高氧环境对兔主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用，间接判断缺氧与冠脉再狭窄的关系和研究氧疗是否能用于PTCA支架后冠脉再狭窄的防治. 方法 用含100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液体外培养新西兰白兔的主动脉平滑肌细胞至3～7代，将含50mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液与动脉平滑肌细胞的混悬液100μL加入96孔培养板中培养，按照实验分组分别在100，210，250，500和750mL・L-1 O2 及纯氧环境中培养主动脉平滑肌细胞48h.用MTT法和3 H-TdR掺入法检测动脉平滑肌细胞增殖的数量. 结果 以210mL・L-1 O2 环境下动脉平滑肌细胞增殖的数量为基准对照组，其他各组为实验组.500mL・L-1 O2 至纯氧环境下动脉平滑肌细胞的增殖显著低于对照组（P&<0.05），250mL・L-1 O2 与210mL・L-1 O2 环境下主动脉平滑肌细胞的增殖无显著差异（P&>0.05），100mL・L-1 O2 环境下动脉平滑肌细胞的增殖显著高于对照组（P&<0.05）. 结论 动脉平滑肌细胞的增殖随着培养环境中氧浓度升高而降低，缺氧促进动脉平滑肌细胞的增殖，高氧对动脉平滑肌细胞增殖具有显著的抑制作用;氧疗可能有助于降低冠脉再狭窄率，并为高压氧治疗其他以动脉血管平滑肌细胞增殖为主的疾病提供理论根据.
Keywords:oxygen;arterial smooth muscle cells;coronary restenosis
Abstract:AIM To investigate the effect of different oxygen percent on the proliferation of aortic smooth muscle cells（ASMCs），indirectly assess the relation between the anoxia and coronary restenosis and observe if oxygen therapy can be used to treat the coronary restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty（PTCA）and in-stent.METHODS New Zealand rabbit ASMCs were cultured in vitro with RPMI1640including100mL・L-1 calf plasma.100μl mixture of ASMCs and RPMI1640including50mL・L-1 calf plasma was put in every cavity of96-hole plate to culture for24h.Then ASMCs were cultured for48h in dif-ferent mixture that consists of oxygen and N2 according to ex-perimental groups（100mL・L-1 O2 ，210mL・L-1 O2 ，250mL・L-1 O2 ，500mL・L-1 O2 ，750mL・L-1 O2 ，1000mL・L-1 O2 ）.MTT method and3 H-TdR incorporation monitored the numbers of ASMCs proliferation.RESULTS Number of ASMCs proliferation in500mL・L-1 O2 ，750mL・L-1 O2 ，1000mL・L-1 O2 groups were significantly lower than that in210mL・L-1 O2 group（P&<0.05），higher in100mL・L-1 O2 group（P&<0.05），but similar in250mL・L-1 O2 group（P&>0.05）.CONCLUSION The oxygen therapy could be used to prevent and treat the coronary restenosis after PTCA and in-stent.
0 引言
氧是人体代谢必不可少的元素，缺氧可以导致动脉血管平滑肌细胞（ASMCs）过度增殖1］ .但是高氧对ASMCs增殖的抑制作用却很少有报道.ASMCs过度增殖是造成经皮腔内冠脉成形术（PTCA）和支架术后冠脉再狭窄的主要病因［2］ ，因此，研究高浓度氧对ASMCs增殖的抑制作用具有重要的临床意义.
1 材料和方法
1.1 材料 高氧与缺氧细胞培养室:本实验室自制;CO2 培养箱（MODEL2300）:美国Sheldon制造公司生产;酶联免疫检测仪（DG3022A）:华东电子管厂生产;新西兰白兔，体质量（1.5±0.5）kg，由本校实验动物中心提供;小牛血清:浙江生物制品研究所生产;RPMI1640培养基:美国Sigma公司生产;2，5-二甲苯基恶唑（PPO），1，4-双-（5-苯基恶唑）苯（POPOP）:上海化学试剂一厂生产;二甲苯:西安化学试剂一厂生产;四唑盐（MTT）:华美生物工程公司提供;3 H-TdR:中国科学院上海原子能研究所生产.
1.2 ASMCs的体外培养 无菌取出新西兰白兔主动脉段，刮除内膜后，剥脱中膜的平滑肌层，按照Ross贴片法用含100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液培养ASMCs，在CO2 孵箱中静置培养7d后，可见细胞开始从组织块边缘爬出，待细胞生长到一定密度后即传代培养，取其3～7代实验.
1.3 ASMCs鉴定 ASMCs在相差显微镜下呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏呈“峰”“谷”状.透射电镜下ASMCs的胞质内有很多与细胞纵轴平行的肌丝及与其相联的致密体，部分细胞周围可见基膜（Fig1）.α-肌动蛋白抗体染色时呈现淡蓝色的ASMCs胞核周围有淡棕色的阳性肌丝.
图1 略
1.4 ASMCs增殖数量的检测 四唑盐比色法（MTT）:将含50mL・L-1 小牛血清的RPMI1640 培养液与ASMCs的混悬液（细胞密度为1×107 ・L-1 ）100μL加入96孔培养板中培养24h.实验分6组，Ⅱ组为对照组，在常氧下培养;其余各组（Ⅰ，Ⅲ～Ⅵ）为实验组，分别在100，250，500和750mL・L-1 O2 及纯氧状态下持续培养48h，然后每孔加入MTT溶液（50mg・L-1 ）20μL，继续孵育4h后终止培养;吸弃上清液，每孔加入50μL DMSO，振荡10min，然后用酶联免疫检测仪测定各孔A690nm .3 H-TdR掺入实验:将1×107 ・L-1 细胞混悬液置于96孔板中（100μL/孔），并加入含100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液，静置培养24h后换成含50mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液，并根据实验分组分别在100，210，250，500和750mL・L-1 O2 及纯氧状态下持续培养48h，然后加入3 H-TdR，继续培养6h后终止反应.用“9999”型纤维滤纸和ET-II型微量细胞收集仪收集细胞，滤纸经红外线烤箱烘干后，分别置于闪烁瓶中加入PPO/POPOP二甲苯闪烁液，在液体闪烁计数器上测定cpm值.
2 结果
各实验组ASMCs增殖的A490nm 值和cpm值的检测统计数据见Tab1.各高氧实验组ASMCs的增殖均受到不同程度的抑制，而缺氧则促进ASMCs增殖.统计检验结果表明:ASMCs增殖的A490nm 值和cpm值Ⅱ组与Ⅰ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组有显著差异（P&<0.05），但与Ⅲ组比较无显著性差异（P&>0.05）.氧对ASMCs增殖的抑制作用随着氧浓度的增强而增强，两者几乎呈线性变化关系.
表1 各氧浓度实验组与对照组ASMCs增殖的A490nm 值和cpm值 略
3 讨论
ASMCs过度增殖的相关影响因素很多，经过多年的研究已初步明确了缺氧、高脂血症、内皮素、血管紧张素、凝血酶、血小板衍生因子、吗啡和去甲肾上腺素等均可促进ASMCs的增生［1，3，4］ .抑制因子的研究已初步阐明肝素、NO，前列腺素、心房肽和血管转换酶抑制剂等能够抑制ASMCs的过度增殖［4，5］ .临床观察资料显示，促ASMCs增殖拮抗因子和ASM-Cs增殖抑制因子的应用虽然有一定的疗效，但并没有彻底抑制ASMCs的过度增殖，仍有一定的冠脉再狭窄率（15%～25%）［2］ .这一结果提示除上述影响因素外，可能还有其他的促增殖因子或抑制因子存在.对促ASMCs增殖的一系列实验研究显示，正常生理血压的1.5～2.5倍压力和缺氧是另一个促增殖因素，而高氧状态则是ASMCs过度增殖的又一抑制因子.
发生粥样硬化、钙化或炎症损伤的动脉血管壁氧供应发生障碍，处于低氧状态，在一定程度上促进了ASMCs的增殖.Xiao［6］ 的研究认为缺氧能诱发血管平滑肌细胞内Ca2+ 释放与细胞外Ca2+ 的内流，导致细胞内Ca2+ 离子浓度升高，进而促进ASMCs的增殖.该理论与本实验的结果共同提示:在应用ASM-Cs促增殖因子拮抗剂和抑制剂的基础上每日辅助吸入高浓度氧或高压氧仓治疗将有助于减轻ASMCs的过度增殖，减少冠脉再狭窄的发生，但有待进一步的临床试验和观察.
参考文献:
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