作者：王贤辉 陈志南 郭晓楠
【关键词】 CD147
关键词: CD147;基质金属蛋白酶;肝癌细胞
摘 要:目的 研究CD147与MMPs（基质金属蛋白酶）在肝癌细胞系中表达的相关性. 方法 流式细胞仪检测正常肝细胞QZG及不同肝癌细胞系（BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721，HHCC和HHCC-9204）中CD147的表达;酶谱法分析其产生MMPs的含量及活性. 结果 正常肝细胞株QZG中CD147表达阴性，其余5株肝癌细胞系CD147表达阳性;MMP-2和MMP-9在QZG和肝癌细胞系中均表达，但在肝癌细胞系中表达明显增高;MMP-9以酶原和活性形式表达，MMP-2仅以酶原形式表达;统计学分析CD147与MMPs表达成正相关. 结论 CD147可作为判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的标志.
Keywords:CD147;MMPs;hepatoma cells
Abstract:AIM To study the relation between CD147and the expression of MMPs in hepatoma cell lines.METHODS Expression of CD147in human liver cell QZG and different hepatoma cell lines（BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721，HHCC，HHCC-9204）was investigated by flow cytometer.Zymograph was used to study the content and types of posi-tive MMPs.RESULTS CD147was positively presented in five hepatoma cell lines，but in normal liver cell was nega-tive.MMP-2and MMP-9were detected by all the hepatoma cell lines and normal liver cell but the expression in hepatoma cell lines was obviously high.The relation between CD147molecule and the expression of MMPs was a positive one.CONCLUSION CD147could be used as a marker to judge the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma.
0 引言
大量研究显示MMPs（基质金属蛋白酶）与多种肿瘤的侵袭转移有关［1］ ，其中IV型胶原酶（MMP-2明胶酶A和MMP-9明胶酶B）通过降解基底膜IV型胶原在恶性肿瘤早期的侵袭中起重要作用［2，3］ .CD147是新的细胞表面粘附分子，介导细胞间的粘附，具有TCSF/EMMPrin（肿瘤细胞起源的胶原酶刺激因子/细胞外基质金属蛋白酶诱导因子）的作用，而有助于癌细胞的侵袭转移［4，5］ .然而CD147在肝癌细胞表面的表达，以及肝癌细胞产生MMPs的形式及活性，尤其是两者的相关性研究未见报道.我们利用酶谱法（zymograph）及流式细胞仪对MMPs和CD147在肝细胞及肝癌细胞的表达进行研究，以揭示CD147与MMPs的相关性，并探讨以CD147为标志判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的可能性.
1 材料和方法
1.1 材料 抗CD147mAb为美国pharMingen公司产品，FITC-羊抗鼠IgG购自华美生物工程公司，ELITE ESP型流式细胞仪为美国库尔特公司产品，正常人肝细胞系QZG，人肝癌细胞株BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721和人肝癌细胞系HHCC均来自中科院上海细胞所细胞库，HHCC-9204由本室建立，培养用含有100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养基.
1.2 方法
1.2.1 FCM定量检测CD147mAb的结合率 收集对数生长期的细胞制备高活性单细胞悬液至浓度（5～10）×109 ・L-1 ，正常马血清封闭非特异位点加饱和CD147mAb5mg・L-1 4℃静置30min，DPBS离心洗涤2次加FITC-IgG孵育30min，4℃，离心洗涤后固定液固定，待测.同时设无关mAb抗乙脑病毒IgG为阴性对照.
1.2.2 细胞培养及细胞上清收集沉淀 上述6株细胞采用RPMI1640完全培养基培养，置于37℃含50mL・L-1 CO2 培养箱内，待细胞长满培养瓶（100mm×15mm），用无血清RPMI1640培养液洗涤3次后加含20mL・L-1 胎牛血清RPMI1640培养3d，收集上清，梯度离心800g，15min，15000g，30min，上清用800g・L-1 饱和硫酸铵沉淀，4℃，8h，15000g，30min收集沉淀用10mmol・L-1 Tris-HCL，pH7.5透析除盐.
1.2.3 明胶酶谱法［6］ 透析后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，其中分离胶含1g・L-1 的明胶.电泳结束后将凝胶置于洗脱液（25mL・L-1 Tristion X-100，50mmol・L-1 Tris-HCl，pH7.5，0.1mol・L-1 NaCl）室温洗2次，45min/次，接着将凝胶置于孵育液（50mmol・L-1 Tris-HCl，pH7.5，10mmol・L-1 CaCl2 ，0.2g・L-1 NaN3 ）37℃孵育24h以上，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色，蓝色背景上出现MMPs透亮带.经图像分析系统读取条带面积和酶解条带灰度，酶含量=条带面积×（条带灰度―背景灰度）.
统计学处理:结果以x ±s表示，分析线性相关性，检验相关系数.
2 结果
2.1 FCM测定CD147mAb标记细胞阳性率及平均荧光强度 CD147分子在不同肝癌细胞系中均表达阳性，以阴性对照荧光强度12.6±10.4为参照，CD147分子在HHCC中表达强阳性，在SMMC-7721中表达弱阳性，在正常肝细胞QZG中表达阴性（Tab1）.
表1 CD147在不同细胞系中的阳性率及平均荧光强度 略
2.2 不同细胞系的明胶酶谱和MMPs酶含量的测定 不同细胞系的明胶酶谱显示在蓝色背景的3条透亮条带，A带为MMP-9酶原形式，分子质量92ku;B带为激活的MMP-9，分子质量86ku;C带为分子质量72ku酶原形式的MMP-2（Fig1）.经图像分析系统测定各明胶酶的含量（Tab2）.
图1 略
表2 MMPs在不同细胞系中的含量 略
2.3 CD147荧光强度与MMPs┐9含量的相关性 经过统计学分析肝癌细胞与正常肝细胞QZG，CD147mAb平均荧光强度有明显差异（P&<0.05），而其MMPs酶总量的分泌之间也具有明显差异（P&<0.01）.6株细胞系CD147mAb平均荧光强度X与其MMPs总量Y之间经相关性检验相关系数r=0.9183，P&<0.01.线性回归方程为Y=80370.4+2030.8X.
CD147分子属IgSF中高度糖基化的单次跨膜糖蛋白，主要参与细胞-细胞或细胞-基质的粘附.曾有实验表明表达于肺癌细胞系LX-1表面的该分子可刺激人成纤维细胞分泌MMPs而有助于癌细胞的浸润扩散［7］ .另有文献［8，9］报道肿瘤细胞表达的CD147分子可作用于邻近的癌细胞，相互诱导促进MMPs释放降解基质，并水解肿瘤细胞表面的粘附成分而有助于癌细胞的迁移.因此，CD147分子在肿瘤细胞的侵袭转移中起重要作用.我们的实验发现CD147分子在肝癌细胞系与正常肝细胞表面的表达呈现显著差异.另外，IV型胶原酶MMPs-2和MMPs-9的分泌及活性形式在两者之间亦有明显不同，在肝癌细胞中明显高于正常肝细胞.尤其以MMP-9的含量增高为主［10］ .据文献［11，12］报道，在恶性度高的肿瘤组织中MMP-9的表达上调而且其含量随癌细胞转移率的增高而增加，并以103ku，92ku的酶原形式及86ku的活化形式表达，表明MMP-9与肿瘤细胞的关系更为密切.我们的实验证实CD147分子表达于多株肝癌细胞表面，而正常肝细胞为阴性表达，同时检测了其培养上清中与恶性肿瘤转移密切相关的IV型胶原酶MMP-2和MMP-9的表达及活性形式.CD147分子的表达的确与MMPs的含量呈正相关，表明肿瘤细胞表面的CD147分子可刺激和激活自身MMPs的释放而促进癌细胞的侵袭转移，因此CD147分子可作为肝癌细胞侵袭转移的间接标志.
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