作者：韦耿泽 朱运龙 王高峰 韩雪峰 胡玉珍 钟延清 陈健康
【关键词】 白细胞介素-2
关键词: 白细胞介素-2;垂体前叶;逆转录-聚合酶链反应;鼠
摘 要:目的 研究白细胞介素-2（IL-2）mRNA在正常大鼠垂体前叶的表达. 方法 从正常大鼠垂体前叶组织和离体原代培养的细胞中提取总RNA，采用二步法RT-PCR技术，扩增出相应大小的DNA片段，将此片段通过凝胶电泳回收纯化后与pGEM-T easy载体连接，转染到大肠杆菌细胞内，并接种于LB培养基中培养10～14h，挑选出阳性克隆进行DNA序列测定. 结果 测定的DNA与IL-2基因片段相同.因而，在正常大鼠垂体前叶组织和培养细胞中都有IL-2mRNA的表达. 结论 首次证实了IL-2不仅存在于垂体肿瘤组织中，而且在正常垂体组织中也有表达.为进一步研究神经内分泌网络学说提供了一定的理论基础.
Keywords:IL-2;anterior pituitary;RT-PCR;rats
Abstract:AIM To study the expression of IL-2mRNA in rat normal anterior pituitary.METHODS Total RNA was extracted from rats’normal anterior pituitary tissues and pri-mary cultured cells in vitro.Using the two-step RT-PCR technique，we amplified a DNA fragment in comparatively the same length as that of IL-2mRNA.Through DNA a-garose gel electrophoresis，the fragment was purified and then connected with pGEM-T easy plasmid by the T4ligase.The connected plasmid was transformed into the E.coli cells. The transformed cells were planted in the Amp+LB culture medium and cultured for10～14h.The positive clones were selected and then the DNA sequencing was conducted.RE┐SULTS The DNA sequence was the same as that of the IL-2gene fragment.Therefore，there existed IL-2mRNA in rats’normal anterior pituitary tissues and cultured cells.CON┐CLUSION It is proved，for the first time，that IL-2not on-ly exists in the tissues of pituitary adenoma，but is also ex-pressed in the normal pituitary tissues.
0 引言
白细胞介素-2（IL-2）对下丘脑-垂体-靶腺具有明显的调节作用.外源性IL-2既可以直接作用于垂体组织，影响垂体激素的分泌，也可以通过调节下丘脑促垂体激素的释放，间接影响垂体激素的分泌［1，2］ .近来发现，垂体瘤细胞在基础条件和不同的刺激条件下可以产生和分泌IL-2［3］ ，但是正常垂体组织是否存在IL-2还未见报道.我们拟应用RT-PCR方法，从基因水平确定大鼠正常垂体前叶中是否有IL-2表达.
1 材料和方法
1.1 材料 胰蛋白酶为Difco公司产品，DMEM培养基及Trizol试剂为美国Gibco公司产品，新生小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品，反转录试剂盒、PCR反应试剂盒及pGEM-T载体为美国Promega公司产品，T4DNA连接酶为华美生物工程公司产品，感受态细胞为本校基础部生物化学和分子生物学教研室惠赠，PCR扩增仪为英国JENCONS公司产品.
1.2 大鼠垂体前叶细胞原代培养 雄性SD大鼠，体质量200～250g，用10g・L-1 戊巴比妥钠（30mg・kg -1 ）腹腔麻醉后，20mL无菌生理盐水灌注，迅速浸入750mL・L-1 乙醇中5～10min，于无菌条件下开颅取出垂体，剔除后叶及中间叶.前叶经D-Hank’s液冲洗4次后，切成小于1mm×1mm×1mm组织块，1.25g・L-1 胰蛋白酶37℃振荡（100r・min-1 ）温育30min.用吸管吹打分散细胞，将细胞悬液吸入加有完全培养液的离心管，终止消化（若消化不完全可将其余组织重复消化1～2次）.于200g离心10min，弃上清液后，向沉淀的细胞团滴加含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养液使其重悬并分散，种植于90mm2 培养皿，50mL・L-1 CO2 和37℃恒温培养箱中培养5～7d，待行总RNA的提取.
1.3 总RNA的提取 用10g・L-1 戊巴比妥钠（30mg・kg-1 ）腹腔麻醉后，100mL无菌生理盐水灌注，立即开颅显露垂体，去除后叶及中间叶.将前叶置入预先装有1mL冰预冷的Trizol液的匀浆器中，充分匀浆裂解后（上述培养5～7d的细胞，可直接将1mL Trizol加到培养皿中，并轻摇培养皿至显微镜观察细胞全部漂浮在液体中为止，其余步骤相同），移入1.5mL离心管中，室温静置5min，加入0.2mL氯仿，摇匀，于室温下静置15min，接着4℃10000g离心15min，将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，摇匀，室温静置10min后，4℃10000g离心10min，弃掉上清液，750mL・L-1 乙醇清洗1次，将RNA沉淀晾干，用20μL无RNA酶水55℃溶解10min，-20℃保存待用.
1.4 两步法RT┐PCR反应
1.4.1 cDNA的合成 20μL的cDNA合成反应体系（提取的总RNA5μL，25mmol・L-1 MgCl2 4μL，10×反转录缓冲液2μL、RNA酶抑制剂0.5μL、AMV反转录酶1.5μL、引物1μL、其余用无RNA酶水补充至20μL），在42℃水浴60min，沸水浴5min灭活反转录酶，4℃，5min使酶与cDNA分离.
1.4.2 PCR反应 取合成的cDNA模板（对照组用去离子水）1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，4×dNTP混合物2μL，IL-2引物（sense:5’GCGCAC-CCACTTCAAGCCCT3’，antisense:5’CCAC-CACAGTTGCTGGCTCA3’由赛百盛生物公司合成）各0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，去离子水补至25μL，首次循环为94℃4min，中间循环94℃1min，60℃45s，72℃1min，循环35次，末次循环72℃10min充分延伸.
1.5 PCR产物的鉴定 PCR产物用15g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，得到预期大小的单一条带并回收.回收的产物与pGEM-T载体连接.连接反应体系:5μL T4DNA连接酶缓冲液，1μL pGEM-T载体，2μL回收产物，1μL T4DNA连接酶，去离子加至10μL，混匀后4℃过夜.加入200μL感受态细胞，冰浴30min后，42℃热休克90s，迅速冰浴2～3min，加0.8mL LB培养基，37℃培养30～45min，最后接种于含 氨苄青霉素和LB的培养皿中，37℃培养12～16h，挑选阳性克隆进行DNA序列测定.
2 结果
2.1 凝胶电泳分析 与对照组相比，大鼠垂体组织和培养细胞都有一条约350～370bp的特异条带.基本与所设计引物间的片段大小相符合（Fig1）.
图1 略
2.2 DNA序列测定 将测定结果与基因文库比较，350bp片段中除有一个碱基突变外，其余和IL-2完全一致.IL-2DNA序列测定的部分结果（见Fig2）.
图2 略
2.3 IL┐2mRNA在大鼠垂体前叶的表达 通过电泳分析和序列测定，说明在正常大鼠垂体前叶有IL-2基因表达.
3 讨论
我们的实验结果表明，在正常大鼠垂体前叶有IL-2mRNA的表达.结合我们以前的研究，肯定大鼠垂体前叶有IL-2分布，免疫组织化学显示主要为垂体前叶分泌GH，ACTH和PRL的细胞.已经发现人垂体促皮质腺瘤和一些垂体瘤细胞系都可以表达IL-2［3，4］ .故此基本可以认为IL-2存在于垂体组织中.但是IL-2对不同类型的垂体细胞的增殖作用不同.有人报道，IL-2抑制正常垂体细胞的增殖而促进GH3 细胞的增殖，IL-2对GH3 的增殖作用与雌激素有关［5，6］ .我们也发现IL-2对垂体细胞的增殖作用与性别有关（IL-2促进雌性大鼠垂体细胞的增殖，抑制雄性大鼠垂体细胞的增殖）［7，8］ .说明IL-2与垂体肿瘤的形成过程有一定的关系，目前具体机制还不清楚，需要进一步的研究.
总之，无论是垂体肿瘤细胞还是正常垂体细胞都可以表达IL-2，它们所产生的内源性IL-2可以影响垂体细胞的增殖和调节垂体激素的分泌.当外界环境发生改变后，IL-2的调节作用也会变化.IL-2也许与垂体细胞的肿瘤形成有关，这可能需要多种因素的参与.
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