【关键词】 前列腺肿瘤
关键词: 前列腺肿瘤;癌;单链抗体
0 引言
前列腺特异抗原（prostate-specific antigen，PSA）是一种灵敏度较高的肿瘤标志物［1］ .抗PSA/CD3双特异单链抗体（single chain antibody，ScFv），能同时识别T细胞上的CD3分子和前列腺癌的特异性抗原PSA.我们在已构建抗CD3ScFv和抗PSA ScFv的基础上［2，3］ ，利用基因重组技术，构建了抗PSA/CD3双特异ScFv，并进行了原核表达.
1 材料和方法
1.1 主要材料与试剂 抗PSA ScFv（E4 B7 ScFv）重组质粒由本室构建并保存.抗CD3ScFv由本校生化教研室白玉杰博士构建并惠赠.pUC19-Linker质粒由本校生化教研室高磊博士构建并赠送，Linker在pUC19中的位置见图1.
1.2 PCR引物设计 根据E4 B7 ScFv和抗CD3ScFv基因序列，以及pUC19-Linker质粒中Linker的位置，设计并合成了用于E4 B7 ScFv和抗CD3ScFv基因扩增的引物.序列如下: A:5’-GC GAATTCATGCAGGTCCAACTGCAGGA-3’EcoRIB:5’-GT GAGCTCACGTTTGATCTCCAGCTTG-3’SacIC:5’-GC GGATCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3’BamHID:5’-GT GTCGACTAACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC-3’SalI
1.3 双特异单链抗体的构建及序列分析 以A，B和C，D为引物分别扩增E4 B7 ScFv和抗CD3ScFv基因，更换基因两侧的酶切位点.抗CD3ScFv基因的PCR扩增产物和pUC19-Linker质粒经BamHI和SalI双酶切，15g・L-1 琼脂糖凝胶电泳后，用AdvantageTM PCR-Pure Kit回收，用Rapid DNA Ligation Kit连接，转化处于感受态的E.coli JM109菌株，筛选阳性克隆.将阳性菌落提取质粒，与E4 B7 ScFv基因扩增产物使用同样方法连接（构建过程如图1）.将含有双特异ScFv
图1 略
基因的重组质粒用全自动荧光DNA序列分析仪（美国PE373-A型）进行DNA序列分析.
1.4 抗PSA/CD3双特异ScFv的表达 将已测序的抗PSA/CD3双特异ScFv克隆入pGEX-4T-1载体，用终浓度为0.1mmol・L-1 的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase，GST）/双特异ScFv融合蛋白.以120g・L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察表达产物. 转贴于 图2 略
2 结果
2.1 PCR扩增及双特异ScFv的构建 应用引物A，B和C，D分别扩增E4 B7 ScFv和CD3ScFv基因，扩增产物经15g・L-1 琼脂糖凝胶电泳分析，分别得到大小约为740bp和730bp的DNA片段.将抗CD3ScFv和E4 B7 ScFv基因分别克隆入pUC19-Linker质粒后，挑选阳性克隆提取质粒，用EcoRI和SalI双酶切鉴定，可得到大小约为1500bp的DNA片段，与预期大小相符（图2）.
2.2 双特异ScFv的序列分析 用全自动荧光DNA测序仪，对抗PSA/CD3双特异ScFv基因进行了测序.基因全长1523bp，抗PSA ScFv基因长741bp，抗CD3ScFv基因长726bp，与已发表的E4 B7 ScFv和抗CD3ScFv基因完全同源
［2，3］ .Linker序列为45bp，其推导的氨基酸序列为（Gly4 Ser）3 ，与设计的序列相符［4］ .
2.3 抗PSA/CD3双特异ScFv的表达 诱导表达的GST-双特异ScFv融合蛋白进行SDS-PAGE分析，可见一条Mr 约78000的新生蛋白带（图3），与GST相对分子质量（26000）和双特异ScFv片段理论相对分子质量（52000）之和相近.薄层扫描仪确定表达量约占菌体总蛋白的37%.
图3 略
3 讨论
目前认为，机体对肿瘤的免疫防御能力主要是由细胞免疫反应介导的.肿瘤细胞通过不同途径逃避这一反应，使肿瘤得以持续发展.利用同时能识别免疫效应细胞及肿瘤相关抗原的双特异性抗体，可增加肿瘤部位效应细胞的数量并激活效应细胞，使其发挥细胞毒功能［5］ .我们利用基因工程技术制备双特异性单链抗体，具有分子小，免疫原性低，易进入肿瘤内部，易于基因操作和基因工程大量生产等许多优点.本实验中构建的抗PSA/CD3双特异ScFv，相对分子质量约为52000，大小为完整双特异性抗体的六分之一，为进一步探索基因工程双特异性抗体的体内实验研究及用于人体的研究奠定了基础.
参考文献
［1］郭 平，王 浩.前列腺特异抗原的研究进展［J］.国外医学肿瘤学分册，1996;23（5）:303-305.
［2］武国军，郝晓柯，白玉杰etal.抗人精浆蛋白单链抗体基因的构建及序列分析［J］.细胞与分子免疫学杂志，1998;14（3）:191-194.
［3］白玉杰，苏成芝，杨安钢et al.抗人CD3单链抗体的构建及序列分析［J］.细胞与分子免疫学杂志，1996;12（3）:6-11.
［4］Huston JS，Levinson D，Mudgett-Hunter M et al.Protein engi-neering of antibody binding sites:Recovery of specific activity in a anti-digoxin single chain Fv anologue produced in Escherichia coli ［J］.Proc Natl Acid Sci USA，1998;85（16）:5879-5883.
［5］宋毅强，谢 宏.双特异性抗体治疗肿瘤的可行性研究.中国肿瘤生物治疗杂治，1998;5（1）:60-62.转贴于