作者：吴昌归 廖建军 毛宝龄 孙滨
【关键词】 嗜酸粒细胞
关键词: 嗜酸粒细胞;P物质;哮喘
摘 要:目的 探讨P物质（SP）在嗜酸粒细胞（Eos）活化中的作用及机制. 方法 以非连续性Percoll密度梯度分离法分离哮喘患者外周血Eos，了解SP对Eos过氧化物酶（EPO）活性和脱颗粒的调节作用，并以苔盼蓝拒染法评价SP对Eos存活时间的影响.用改良Boyden法，测定SP对Eos的趋化活性，并观察血小板激活因子（PAF）对SP预处理Eos的趋化作用. 结果 SP能显著增强EPO活性，刺激Eos脱颗粒，且与PAF有协同性，但不能延长Eos的存活时间.神经激肽-1（NK1）受体拮抗剂GR71251和磷酯酶C（PLC）抑制剂新霉素能阻断SP的上述作用.SP对Eos有显著趋化作用，其EC50为1×10-14 ～1×10-12 mol・L-1 ，最大趋化浓度为1×10-10 mol・L-1 ，此后随浓度的增加，其趋化作用降低.PAF对Eos的趋化作用因SP预处理Eos而显著强化（P&<0.01），NK1受体拮抗剂GR71251对SP的预处理作用有显著的阻断效应. 结论 SP作用于Eos胞膜上的NK1受体，经百日咳杆菌毒素（PTX）敏感型G蛋白，活化磷酯酶C从而激活Eos.同时SP还是一种Eos的趋化介质，与PAF有协同作用，NK1受体介导了这一协同效应.
Keywords:eosinophils;substance P;asthma
Abstract:AIM To investigate the effect of substance P（SP）on the activation of eosinophils（Eos）.METHODS Eos were collected from peripheral blood of asthmatic sub-jects using a discontinuous Percoll density gradients.The ef-fect of SP on the activation of Eos was evaluated by measur-ing the activity of eosinophil peroxidase（EPO）in Eos and de-granulation of Eos.Effect of SP on the survival of Eos was e-valuated by typan blue dye exclusion.Induced chemotaxis by SP and platelet-activating factor（PAF）was assayed by a modified Boyden’s chamber technique.Induced chemotaxis of pre-treated Eos with SP by PAF was also evaluated in the present study.RESULTS SP could enhance the activity of EPO and stimulate the degranulation of Eos significantly.In the present study，we demonstrated a synergistic effect of SP on the activation of Eos by platelet activating factor（PAF）.But the role of SP could be attenuated markedly by antagonist for NK1receptor，GR71251，inhibitor of phospholipase C（PLC），and neomycine.However，SP didn’t increase the longevity of Eos.SP stimulated Eos migration in vitro with an EC50of about1×10-14 ～1×10-12 mol・L-1 ，and maxi-mal effect was seen at10-10 mol・L-1 .The effect of SP was reduced slowly as its concentration increased.Chemotactic response to PAF（10-7 mol・L-1 ）was significantly enhanced（P&<0.01），when Eos was pre-treated with SP（10-7 ～10-12 mol・L-1 ）.Potentiating effect of SP on PAF-induced Eos chemotaxis was significantly attenuated by antagonist for NK1receptor，GR71251.CONCLUSION SP may be cou-pled the specific receptor（NK-1）on Eos，and activate PLC and then induce the degranulation of Eos.In addition，SP is also a chemotactic mediator of human Eos and synergistic with PAF.NK1receptor is involved in the synergistic effect of SP on PAF.
0 引言
哮喘是一种以嗜酸粒细胞（Eos）和淋巴细胞浸润为主、由多种炎性细胞参与的慢性变态反应性炎症，气道高反应性（airway hyperresponsiveness，AHR）是其重要的病理生理变化.活化的Eos释放多种炎性介质和毒性蛋白，在AHR的形成和发展中起重要作用.近年来研究表明，气道C类感觉神经末梢周围有Eos聚集，其释放的碱性蛋白（MBP）可刺激脊髓背根神经节细胞释放P物质（substance P，SP），推测SP对Eos的功能也可能产生影响，这种反馈环路在哮喘的发病中可能具有一定作用，我们就此进行了探讨.
1 材料和方法
1.1 材料 SP、神经激肽-1（NK-1）受体拮抗剂GR71251、磷酯酶C（PLC）抑制剂新霉素（neomycine）、血小板活化因子（PAF）均为Sigma公司产品，Percoll系瑞典pharmacia产品，酶联分光光度计系第四军医大学寄生虫学教研室研制，微孔滤膜为上海新亚净化器材厂生产.
1.2 方法
1.2.1 人Eos的分离和纯化 取哮喘患者静脉血30mL，按文献［1］分离Eos.
1.2.2 SP对Eos过氧化物酶（EPO）活性和脱颗粒的调节作用
1.2.2.1 SP对Eos EPO活性的影响 取1×109 ・L-1 Eos悬液45μL加入55孔反应板中.在不同浓度SP处理组，每孔加入5μL不同浓度的SP，使其终浓度分别为1×10-10 ～1×10-6 mol・L-1 .对照组每孔加入生理盐水5μL.置37℃孵育2h.按文献［2］报道的方法测定EPO活性，用酶联分光光度计，测A492nm 值，以A492nm 值表示活性.在GR71251处理组中于加入SP前，以GR71251（终浓度为1×10-7 mol・L-1 ），孵育15min.20℃5000r・min-1 离心5min，弃上清，以Hank’s液洗涤管底细胞2次，重悬于45μL的Hank’s液中，以后步骤同上述.每一组测6孔.
1.2.2.2 SP对脱颗粒的影响 参照文献［3］进行.Eppendorf管中加入1×109 ・L-1 Eos悬液180μL和SP20μL（终浓度为1×10-10 ～1×10
-6 mol・L-1 ）.对照组:在不同浓度SP处理组每管加入20μL生理盐水.置37℃孵育2h.然后以20℃5000r・min-1 离心5min，弃上清.用Hank’s液轻轻洗涤管底细胞团2次.重悬于Hank’s液200μL中，超声粉碎仪震荡5min，按文献［2］测EPO活性.在GR71251处理组中，于加入SP前，以GR71251（终浓度为1×10-7 mol・L-1 ），孵育15min.20℃5000r・min-1 离心5min，弃上清，以Hank’s液洗涤管底细胞团2次，重悬于180μL的Hank’s液中，以后步骤同上述.在新霉素处理组中，以SP和新霉素（10-6 mol・L-1 ）共同作用于Eos，以后步骤同上.每一SP浓度级测6孔.
1.2.2.3 PAF对SP致Eos脱颗粒作用的影响 在Eppendorf管中加入1×109 ・L-1 Eos悬液160μL，20μL SP（终浓度为1×10-6 mol・L-1 ）和20μL PAF（终浓度为1×10-6 mol・L-1 ）.在单纯PAF和单纯SP处理组中，除分别加入20μL PAF和20μL SP（终浓度与上述相同）外，尚加20μL生理盐水.在对照组中只加40μL生理盐水.置37℃孵育2h.以后按“方法1.2.2.2”中的程序进行.
1.2.3 SP对Eos趋化活性的调节作用
1.2.3.1 SP对Eos趋化活性测定 按文献［4］报道的改良Boyden法进行.在趋化板下层各孔中加入SP（终浓度为1×10-15 ～1×10-5 mol・L
-1 ）50μL，铺上微孔滤膜（孔径5μm，厚度200μm）和趋化板上层，在上层各孔中加入Eos悬液50μL，置37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱2.5h.然后取出滤膜，用苏木素染色.在高倍光镜下测10个视野内Eos游走的最远距离.用含2mL・L-1 牛血清白蛋白的Hanks液作对照孔.结果用游走指数（MI）表示.MI（%）=测定孔细胞游走距离（μm）/对照孔细胞游走距离（μm）×100%.每一SP浓度级测定5孔.
1.2.3.2 SP对PAF所致Eos趋化作用的影响 在趋化板下层各孔中加入1×10-7 mol・L-1 PAF50μL，在上层各孔中加入Eos悬液或SP预处理的Eos悬液50μL，置37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱2.5h.Eos预处理过程:Eos悬液中加入SP（终浓度1×10-12 ～1×10-7 mol・L-1 ），置37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱30min，以Hanks液洗涤Eos2次，重悬于Hanks液中.
1.2.3.3 NK1受体拮抗剂GR71251对SP与PAF协同作用的影响 基本按上述方法进行.Eos在预处理过程中，先以GR71251（终浓度1×10-7 mol・L-1 ）作用15min.再与SP（终浓度1×10-10 mol・L-1 ）作用30min.
1.2.4 SP对Eos活力的影响 取1×109 ・L-1 Eos悬液（悬液为含100mL・L-1 牛血清白蛋白的RPMI1640）95μL，在其中加入5μL不同浓度的SP（终浓度为1×10-10 ～1×10-6 mol・L-1 ）.以生理盐水作对照.置50mL・L-1 CO2 ，37℃孵箱孵育48h后，用苔盼蓝染色检查其活力.
统计学处理:采用NOSA软件，行方差分析，多组均数间比较采用最小显著差法，两组均数间比较采用t检验.
2 结果
2.1 SP对Eos EPO活性和脱颗粒的调节作用
2.1.1 SP对Eos的EPO活性的影响 SP在1×10-10 ～1×10-6 mol・L-1 广泛浓度范围内具有明显增强EPO活性的作用，且呈浓度依赖关系.这一作用可被1×10-6 mol・L-1 的GR71251所阻断（Fig1）.
图1 略
2.1.2 SP对Eos脱颗粒作用的影响 SP在1×10-10 ～1×10-6 mol・L-1 广泛浓度范围内同样具有诱导Eos脱颗粒，呈浓度依赖性特征.该作用同样受GR71251抑制，新霉素对此也有抑制效应（Fig2）.
图2 略
2.1.3 SP和PAF对Eos脱颗粒的相互影响 SP和PAF诱导Eos脱颗粒效应显著大于任何单一因素，表现出协同作用（Fig3）.
2.2 SP对Eos趋化活性的调节作用
2.2.1 SP对Eos的趋化活性 SP对Eos有显著趋化活性（Fig4）.EC50为1×10-14 ～1×10-12 mol・L-1 ，最佳趋化浓度是1×10-10 mol・L
-1 ，此后随SP浓度的增加，其趋化活性则缓慢下降.
2.2.2 PAF对SP预处理Eos的趋化作用 1×10-7 mol・L-1 PAF对Eos具有明显的趋化效应，SP预刺激Eos后，可使其对PAF的趋化活性大增，但随 着SP浓度的增加，其增效作用减弱.GR71251可完全阻断SP对PAF趋化Eos的增效作用.
图3 － 图4 略
2.3 SP对Eos生存时间的影响 SP在1×10-10 ～1×10-6 mol・L-1 广泛浓度范围内对Eos的体外存活时间无明显影响.
SP主要由C类感觉神经末梢释放，Eos、淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和嗜碱性粒细胞等炎性细胞亦释放SP，某些炎性介质如缓激肽可激活肺内感觉神经末梢释放SP，通过NK1受体引起支气管平滑肌痉挛和神经源性炎症［5，6］ .有研究表明:哮喘个体的支气管肺泡灌洗液中SP含量增多并与FEV1的降低相关［7］ ;粘膜层和平滑肌层中SP能神经纤维密度增加［8］ .在气道壁SP能神经纤维周围有较多Eos浸润.因此推断两者之间存在特殊联系.Dunzendorfer等［9］ 认为Eos和感觉神经末梢的相互作用在肺内Eos浸润性疾病包括哮喘的发病中可能起一定作用.本实验证明，SP广泛浓度范围（1×10-10 ～1×10-6 mol・L-1 ）内有显著增强EPO活性的作用，且呈剂量依赖关系.EPO是Eos特异颗粒的重要成分，在体内参与组成EPO-h3 O2 -卤化物系统，是Eos活性氧的主要来源.活性氧对气道上皮等组织产生炎症性损害.Eos的特殊颗粒中不仅含有EPO，而且还含有Eos阳离子蛋白（ECP）、MBP和Eos源神经毒素（EDN）.当Eos脱颗粒时，释放这些毒性蛋白，导致气道组织损伤.ECP刺激肺内迷走神经C-纤维末梢诱发AHR［10］ ，在哮喘的发病过程中起重要作用.本研究表明:SP促使Eos脱颗粒效应可被NK1受体拮抗剂GR71251和PLC抑制剂新霉素所阻断.提示:SP作用于Eos膜表面的NK1受体，使PTX敏感型G蛋白活化，从而激活PLC，诱发脱颗粒反应.
近年来对速激肽及其受体参与Eos的肺内募集进行了研究.Nenan等［11］ 实验发现速激肽在Eos的肺浸润过程中起一定作用.本研究利用体外实验证实:SP对哮喘患者Eos具有趋化活性.其EC50为1×10-14 ～1×10-12 mol・L-1 ，最大趋化活性浓度为1×10-10 mol・L-1 ，但随着浓度的递增，其趋化活性有逐渐下降之趋势.SP对Eos的趋化机制目前尚未完全清楚.通过刺激支气管上皮细胞释放LTB4等趋化性介质可能是SP引起肺内Eos浸润的机制之一［12］ .PAF作为花生四烯酸的代谢产物，具有广泛的生物学活性，如收缩支气管，诱导形成AHR和炎性细胞在气道中的浸润，是哮喘发病中的重要炎性介质之一［13］ .本研究除证实了SP和PAF在Eos脱颗粒反应中具有协同作用外，还进一步验证了PAF对哮喘患者Eos的趋化作用，并发现PAF的这一作用可被SP显著强化.然而这种强化作用随SP浓度的升高而有所降低.NK1受体拮抗剂GR71251能阻断SP对PAF的这种增强作用.PAF和SP的这种协同作用促进了哮喘的发生和发展.
Eos在体外培养通常不超过2d，加入GM-CSF，IL-5等细胞因子后可延长至1wk以上.Eos存活时间的延长是疾病状态下Eos增多的重要原因之一.哮喘个体在过敏原激发后，支气管肺泡灌洗液和外周血中Eos的成活时间明显长于正常对照组.可能与哮喘患者体内多种细胞因子的相互作用有关.Eos存活时间延长和代谢功能增强是一种比较敏感的活化指标［14，15］ .在体外SP虽能增强EPO活性和促使Eos脱颗粒，但不能延长其存活时间.表明Eos对不 同刺激的活化反应存在着不一致性.
以上研究为NK1受体拮抗剂或（和）PLC抑制剂治疗哮喘提供了实验依据.
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