作者：韩苇 颜真 王俊楼 赵永同 石继红 张英起
【关键词】 翻译起始区域
关键词: 翻译起始区域;SD序列;EPO模拟肽;基因串联体
摘 要:目的 通过改变部分翻译起始区序列观察对EPO模拟肽基因8串联体表达的影响. 方法 设计和人工合成了部分翻译起始区域（translation initiation region，TIR）DNA序列，将该序列插入pBSEPOM8 （含EPO模拟肽基因8串联体序列）的EcoRI和XbaI位点，经DNA测序确定正确重组质粒，再将EPO模拟肽基因8串联体（含改建的翻译起始区域）克隆到pBV220载体的EcoRI和BamHI位点，诱导表达. 结果 DNA测序证明，人工合成的DNA序列已正确插入EPO模拟肽基因8串联体的翻译起始区域.该串联体基因插入pBV220载体后，经42℃诱导，在细菌裂解上清中出现一条相对分子质量为22×103 （Mr ）的新蛋白带，与EPO模拟肽基因8串联体的理论计算分子量相符合.经薄层扫描证明该蛋白带约占细菌蛋白总量的15%. 结论 通过改变部分翻译起始区域起动了EPO模拟肽基因8串联体的翻译，使原来不表达的EPO模拟肽基因8串联体获得了较高水平的表达.
Keywords:translation initiation region;SD sequence;EPO mimetic peptide;gene multiple repeats
Abstract:AIM To observe effect of a synthesized DNA se-quence of translation initiation region（TIR）on expression of8repeats of EOP mimetic peptide gene.METHODS A DNA sequence of translation initiation region was designed，syn-thesized and inserted into EcoRI and XbaI sites of pBSEPOM8 which contained8repeats of EPO mimetic peptide gene.The correct recombinant plasmid DNA was named for pBSE-POM8 B.Then8repeats of EPO mimetic peptide gene which contained synthesized TIR sequence was cloned into EcoRI and BamHI sites of pBV220expression vector.RESULTS DNA sequencing analysis showed that the sequence of syn-thesized TIR was correctly inserted into EcoRI and XbaI sites of pBVEPOM8 B.After recumbent bacterium contained pB-VEPOM8 B was induced at42℃for4h，a new protein band was found on SDS-PAGE gel.The relative molecule mass of the new protein band was about22000（Mr ），consistent with8repeats of EPO mimetic peptide.The protein band amount-ed to15%of total bacteria protein.CONCLUSION Synthe-sized DNA sequence of TIR initiates translation of8repeats of EPO mimetic peptide gene，and so helps improve the pre-viously non-expression of the latter.
0 引言
EPO模拟肽是Wrighton等［1］ 发现的，它是具有EPO生物学功能的小肽.我们已成功地构建和表达了EPO模拟肽基因4串联体，同时也成功地构建了该模拟肽基因8串联体.但后者克隆到pBV220表达载体中，经温度诱导后并未获得表达.一般认为，翻译起始区域（TIR）序列对外源基因翻译的起始影响最大.针对此点，我们重新设计了部分TIR的DNA序列，将此序列插入EPO模拟肽基因8串联体的相应TIR中，以观察其对EPO模拟肽基因8串联体表达的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 ①质粒与工具酶pBSEPOM8 质粒（含EPO模拟肽基因8串联体序列）由本中心构建，pBV220表达载体、DH5α菌株均为本中心保存.各种限制性内切酶购于Gibco公司和上海生物工程公司.②部分TIR序列的设计与合成全序列设计共38bp，在序列的两端分别设计了EcoRI和XbaI酶切位点，便于克隆.SD序列与起始码的距离为7bp.起始码后加入3个氨基酸密码子，设计合成序列如下: EcoRISD5’ AATTC ACA TTGC AAGGAG TTT ATAA ATG AGT ATC GATTG TGT AACG TTCCTC AAA TATT TAC TCA TAG CTAAGATC 3’XbaIDNA序列的合成由上海生物工程公司完成.
1.2 方法 ①所有的质粒DNA提取、消化、回收片段与连接转化均参照文献进行［2］ .②SDS-PAGE参照文献进行［2］ .③DNA测序采用PE公司377型全自动序列分析仪进行.④合成的TIR序列与EPO模拟肽基因8串联体的重组将合成的DNA片段加水溶解，在65℃水浴中加热10min，退火.取pBSE-POM8 质粒DNA以EcoRI和XbaI酶切后回收大片段，将此大片段与上述退火的DNA片段连接后转化DH5α感受态细胞，挑取转化菌落培养后提取质粒DNA进行DNA测序，获得的正确序列重组质粒称为pBSEPOM 8 B.构建过程如Fig1所示.⑤pBVE-POM8 B表达载体的构建及诱导表达以EcoRI和BamHI酶切pBSEPOM8 B质粒DNA，电泳回收EPO模拟肽基因8串联体（含改变的TIR序列）小片段，将此小片段插入经相同内切酶消化的pBV220载体，转化后挑取重组菌落培养，提取质粒DNA，以EcoRI和BamHI酶切鉴定.将含正确重组质粒pB-VEPOM8 B的菌液以1∶100接种于5mL LB培养基中，30℃培养过夜，次日以1.5∶100转接LB培养基后30℃培养至指数生长期，迅速转至42℃继续培养4h，离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析.
2 结果
2.1 TIR序列与EPO模拟肽基因8串联体重组的鉴定 按照设计的重组方案获得了若干重组菌落，提取质粒DNA后进行了DNA测序分析，结果表明合成的部分TIR序列已正确地插入翻译起始区域，和设计序列完全相同.
2.2 pBV220EPOM8 B的构建与表达鉴定 重组的pBVEPOM8 B经EcoRI和BamHI酶切后，电泳鉴定结果（Fig2）表明，EPO模拟肽基因8串联体（含合成的TIR序列）已成功克隆到pBV220表达载体中，酶切小片段约为680bp，与理论计算值相符.含有上述pBVEPOM8 B重组菌42℃诱导4h后，经SDS-PAGE分析，结果（Fig3）表明在裂解上清中出现了一条新的蛋白质带，其相对分子质量约为22×103 ，该相对分子质量与理论计算值相符，即EPO模拟肽基因8串联体基因获得了表达.经薄层扫描仪扫描，其表达量约占菌体总蛋白的15%.
3 讨论
影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素虽有多种，但主要集中在两个方面:一个是对转录水平的影响因素;另一个是对翻译水平的影响因素.近年来的研究认为，翻译水平的影响因素对外源基因的表达更为重要.外源基因翻译的起始过程对翻译效率起着决定性作用，而TIR的DNA序列是否合理，又决定翻译能否起始.换言之，如果能使TIR序列获得最佳优化，则有可能起始外源基因的翻译或提高其翻译的效率.由于对不同的基因而言，TIR的最佳优化条件各不相同，故目前尚无一个可以适用于所有基因TIR的固定模式可遵循.本研究对TIR的调整和改造主要有两点:一是调整SD序列与AUG之间的距离.在TIR中调整SD序列与AUG的距离最有可能起动翻译过程，根据文献报道，SD序列和AUG间的距离为5～10bp时，翻译起始效率最高［3，4］ ，故我们将SD序列和AUG间的距离调整为7bp.二是在AUG之后加入了3个氨基酸密码子，它们是AGT ATC GAT.
图2 － 图3 略
有资料显示，外源基因的第2个密码子可影响基因翻译的起始效率［5］ ，第2个密码子的不同，引起表达量的差别可达15倍［6］ .我们选择的这3个氨基酸是ERA蛋白［7］ AUG后的3个氨基酸，Era在温度诱导载体中是一个高水平表达蛋白，其表达量可达 80%，我们推测Era的AUG后的氨基酸序列可能更利于翻译的起始，故选择了这3个氨基酸.因为EPO模拟肽基因8串联体在表达后还需要裂解为单体，所以在AUG后加入的3个氨基酸残基不会对该串联体的终产物产生不良影响.由于我们同时对部分TIR进行了两处改变，所以EPO模拟肽基因8串联体的表达是两者的综合作用或是其中一方的作用，目前尚无法确定.本研究改变了EPO模拟肽基因8串联体上游的部分TIR序列，使原来不表达的EPO模拟肽基因8串联体得以表达，表明我们对部分TIR的改变使该区域序列得到了优化，从而起始了8串联体的翻译，为研究TIR对外源基因表达的作用提供了一个新的实验证据.
参考文献
［1］Wrighton NC，Farrell FX，Chang R，Kashyap AK，Barbone FP，Mulcathy LS，Johnson DL，Barrett RW，Jolliffe LK，Dower WJ.Small peptides as potent mimetics of the protein lformone erythropoietin ［J］.Science，1996;273（2）:458-463.
［2］Sambrook J，Fritisch EF，Maniatis T.Molecular cloning:A laboratory manual ［M］.2nd.New York:CSH，1989:16-26，36，18，47-18，56.
［3］Wang G，Liu N，Yang K.High level expression of prochymosin in Escherichia coli:Effect of the secondary structure of the ribo-some binding site ［J］.Protein Expr Purif，1995;6（3）:284-290.
［4］Marquis DM，Smolec JM，Katz DH.Use of a portable ribo-some-binding site for maximizing expression of a eukaryotic gene in Escherichia coli ［J］.Gene，1986;42（2）:175-183.
［5］Ringquist S，Shinedling S，Barrick D，Geen L，Binkley J，Stor-mo GD，Gold L.Translation initiation in Escherichia coli:Se-quences with the ribosome-binding site ［J］.Mol Microbiol，1992;6（9）:1219-1229.
［6］Looman AC，Boldlaender J，Comstock LJ.Influence of the co-den following the AUG initiation coden on the expression of a modified lac Z Gene in Escherichia coli ［J］.EMBO J，1987;6:2489-2492.
［7］Chen SM，Donald LC.Era high expression of Era gene ［J］.Shengwu Gongcheng Xuebao（Chin J Biotechnol），1991;7（3）:201-206.