关于放射治疗对人宫颈癌组织的增殖细胞核抗原表达的影响

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　　　　 作者：魏丽春　石梅　郭燕　杨守京　刘惠玲　陈良为

【关键词】 增殖细胞核抗原
　　关键词: 增殖细胞核抗原;宫颈癌;放射疗法
　　摘 要:目的 探讨放射前、后人宫颈癌组织增殖细胞核抗原（PCNA）表达的变化. 方法 在多聚甲醛固定的活检癌组织冰冻切片上，进行PCNA的免疫组织化学染色. 结果 放疗前的宫颈癌组织内，多数癌细胞呈PCNA免疫染色阳性;照射（30～40Gy）后，多数癌细胞无PCNA染色，但间质细胞的PCNA免疫染色明显升高，大量间质细胞则呈中等或强阳性染色. 结论 放射抑制宫颈癌细胞的PCNA表达的同时，诱导间质细胞的PCNA表达.提示PCNA的表达状态可作为放射治疗中评价宫颈癌细胞增殖和间质组织修复的分子指标之一.
　　
　　Keywords:proliferating cell nuclear antigen;cervical cancer;radiotherapy
　　
　　Abstract:AIM To investigate changes of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression following irradiation in the human cervical cancer.METHODS Immunohis-tochemical staining for PCNA was performed in freezing sec-tions of formalin-fixed cervical cancer biopsy tissue.RE┐SULTS Majority of cancer cells showed PCNA-immunoreac-tivity before irradiation.Following irradiation（30～40Gy）PCNA-immunopositive staining was hardly detected in most of cancer cells.PCNA-immunoreactivity，however，increased after radiotherapy，and moderate or heavy immunopositive staining for PCNA was seen in irradiated mesenchymal tissue cells.CONCLUSION Irradiation inhibits PCNA expression in cervical cancer cells whereas it induces the expression of PCNA in mesenchymal tissue cells.The present results sug-gest that expression of PCNA may be regarded as a molecular marker for evaluating the cancer cell proliferation and mes-enchymal tissue repair during radiotherapy of human cervical cancer.
　　
　　0 引言
　　
　　宫颈癌是人类发病率很高的恶性肿瘤，放射治疗对它具有明确有效的治疗效果，放疗后的远期生存率较高.因此，探讨宫颈癌的放射生物学机理，对于提高肿瘤的整体放射水平可能具有重要的意义.增殖细胞核抗原（PCNA）是一种高度保守的蛋白分子，具有参与DNA复制和DNA修复的功能，PCNA的表达情况是反映细胞增殖状态的重要指标［1-3］ ，研究资料表明PCNA在宫颈癌组织中有表达［4-6］ ，但PCNA在宫颈癌放射治疗中的意义，有待于进一步阐明.因此我们利用免疫组织化学等方法，对放射治疗中宫颈癌组织PCNA的变化及其意义进行了探讨.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 临床资料与活检材料 宫颈癌活检组织标本18例，取自临床病理诊断为鳞状细胞癌患者，病理分级为Ⅰ-Ⅱ.患者年龄为36～56岁.其中，放疗前标本8例，放疗后标本10例.接受放射治疗的患者分别接受盆腔照射30～40Gy/15～20次.宫颈癌活检组织标本，入40g・L-1 多聚甲醛0.1mol・L-1 的磷酸缓冲液（pH7.4），4℃下固定24～48h.然后换入30g・L-1 蔗糖溶液内，4℃下过夜.冰冻连续冠状切片，切片厚10μm，每例取30张切片，按顺序分为3套，置于-20℃保存备用.染色前将切片晾干，然后分别作常规HE染色、PCNA免疫组化染色和对照染色.
　　1.2 免疫组织化学染色（ABC法） 切片于10mmol・L-1 磷酸缓冲盐水（PBS，pH7.4）内洗10min，再入含0.3ml・L-1 过氧化氢溶液内处理30min，用以灭活内源性过氧化物酶.经PBS洗后，入鼠抗PCNA单克隆抗体（浓缩型第一抗体，从博士德公司购买，用含2ml・L-1 正常山羊血清和0.1ml・L-1 Triton X-100的PBS稀释，1∶100）内，于4℃下孵育48h.然后入biotin标记的兔抗鼠IgG（1∶200，Vector公司）溶液内，室温下放置4h.入ABC复合物（1∶200，Vector公司产品）溶液，室温下孵育2h.每次抗体孵育后均用PBS洗，3×10min.最后入DAB/h3 O2 溶液（0.05g・L-1 /0.01g・L-1 ）反应10min.另外，用正常小鼠血清溶液代替特异性第一抗体孵育切片，作为免疫染色对照.
　　
　　1.3 半定量分析 参照以往文献中的定量方法［4，6，7］ ，对PCNA免疫染色阳性细胞的半定量分析，在放疗前（n=8）和放疗后（n=10）活检组织10μm切片（10张/例）上，随机选取一高倍视野，计数单位面积（6.25mm2 ）PCNA免疫阳性细胞数目.
　　
　　1.4 统计学检验 比较放疗前与放疗后两组的PC-NA免疫阳性胞体细胞数目（x ±sx ），进行单因素χ2 检验.
　　2 结果
　　
　　2.1 宫颈癌组织的病理学观察 在HE常规染色的切片上，放射前的宫颈组织可见大量的癌细胞巢状分布，癌细胞呈卵圆形或不规则型，癌细胞增殖旺盛，可见病理性核分裂像，肿瘤间质较少.经15～20次（30～40Gy）的照射后，癌组织明显减少，少数残留的癌细胞呈巢状分布，其间为丰富增生的间质结缔组织，伴有大量的白细胞浸润.
　　
　　2.2 PCNA免疫阳性反应 在应用特异性第一抗体孵育的切片上，PCNA的免疫反应阳性产物呈深棕色，主要定位于细胞核内，少量阳性产物弥散分布在细胞核膜或核周.在用正常血清取代特异性第一抗体进行孵育的切片上，未见到PCNA的阳性染色.
　　2.3 PCNA免疫阳性细胞的分布 放射前宫颈癌组织呈PCNA免疫阳性染色，多数癌细胞呈中等程度的着色，部分免疫染色产物弥散分布在核膜与核周胞质内（Fig1）.放射后的活检组织标本上，残留的癌细胞巢内检测不到明显的PCNA免疫染色，而大量的间质组织细胞显示强阳性的染色（Fig2）.
　　图1 － 图2 略
　　
　　随机选取放射前和放射后标本组织切片，在高倍镜（40×10）视野下，计数相同单位面积（6.25mm2 ）内PCNA免疫阳性细胞数目.可见放射后PCNA阳性癌细胞数降低，而PCNA阳性的间质细胞数目增加（Fig3），经统计学分析（单因素χ2 检验），表明放射前、后PCNA癌细胞与间质细胞数目具有明显的差别（P&<0.01）.
　　
　　图3 略
　　
　　3 讨论
　　
　　本研究发现放射治疗（30～40Gy）可以使宫颈癌组织的PCNA表达下降，PCNA的表达水平从放射前中等程度表达下降为几乎阴性.而放射后间质PCNA的表达则明显增加.提示放射可能影响宫颈癌组织和间质组织细胞的增殖活动.

转贴于 　以往的研究［1-3］ 表明PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种33-36KD的周期蛋白，它是一种DNA聚合酶δ和ε的辅助蛋白，合成于G1和S期，其合成与表达与细胞增殖状态密切相关.PCNA能与几种其他DNA复制与修复因子，如引物识别复合体复制因子C、核酸内切酶Fen-1和DNA连接酶I等结合，参与DNA的复制与修复过程.PCNA在肿瘤组织中的表达有许多报道，其中包括宫颈癌癌前病变和癌组织中的表达.这些研究多认为PCNA的表达可以作为癌细胞增殖状态的生物学标志［4-8］ ，即PCNA的表达强，癌细胞的增殖快，反之，则增殖率低.但对于放射对宫颈癌细胞PCNA表达的影响则缺乏研究.有学者研究食管癌放射中PCNA的表达，发现PCNA的表达有变化，并认为在评价放疗效果中有意义.我们的研究结果表明，放射治疗直接杀死癌细胞的同时，可以抑制宫颈癌细胞增殖，这可能是宫颈癌放疗效果较好的原因之一.提示PCNA的表达的变化可以作为宫颈癌放射治疗效果的分子指标.
　　
　　另一方面，放疗中间质增生是组织对放射损伤的修复反应，放射可诱导间质结缔细胞的PCNA表达，其意义尚有待探讨.体外研究［3］ 表明，放射诱导胚胎成纤维母细胞的PCNA表达，他们认为PCNA的表达与细胞的DNA修复有关.放射对宫颈间质细胞PCNA表达的影响，可能具有相似的作用，但也不能排除PCNA的表达上调是间质细胞增殖旺盛的表现.以往的研究还提示，肿瘤组织PCNA的表达及其变化不是孤立的事件，它与p53，p21等基因的活动有密切的联系［3，10］ ，如p53可能中介放射诱导胚胎成纤维母细胞PCNA的表达，它们共同参与细胞DNA的修复过程.因此，探讨放射对癌组织PCNA及其相关基因活动的影响，有助于认识肿瘤放射敏感 性的基础、以及肿瘤放射生物作用的分子机制，值得进一步深入研究.
　　

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