作者：黄亚渝 郭立安 章必成 胡军 梁峰
【关键词】 色谱法
关键词: 色谱法，液相;补体2;血清;纯化
摘 要:目的 建立一种从血清中提纯C2的方法，得到稳定的、有活性的纯品，便于今后进一步研究其生理病理功能. 方法 利用冷球蛋白沉淀、优球蛋白沉淀、离子交换色谱、硫酸铵沉淀和亲和色谱几种方法，将血清中不同性质的杂蛋白除去，选择相对简单且分离效果好的条件，提高终产物中目标蛋白C2的纯度和含量. 结果 成功地从1L血浆中提纯到了2.49mg C2，产率为12.46%，活性回收率为13.68%.终产物在pH中性时稳定，且无需加入蛋白稳定剂. 结论 本法与以往纯化C2的方法相比，简便可行，产率及活性回收率较高，适用于实验室研究和大规模制备.
Keywords:chromatography，liquid;complement2;serum;purification
Abstract:AIM To establish a method for purification of C2from human serum，to obtain the stable and active purifica-tion and to study its physiological and pathological function easily in the future.METHODS Using a combination of cryoglobulin precipitation，euglobulin precipitation，ion-ex-change chromatography，（NH4 ）2 SO4 precipitation and affinity chromatography，the impurity protein of different quality was removed，and the easy and effective condition was selected to increase the purity and content of C2in the final product.RESULTS 2.49mg final product was homogeneous by the criterion of SDS-PAGE representing the12.46%yield and13.68%activity recovery from1000mL serum.They were stable in pH neutral and no stabilizing agent was needed.CONCLUSION Compared with the past method，this method with high yield and activity can be used for laboratory research and large-scale preparation.
0 引言
补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，它既是生理性的防御物质，又是造成病理性损伤的介质［1］ .补体的分离纯化为进一步研究其生理病理功能奠定了基础.C2蛋白是补体经典激活途径中最早的限速因子.它在血中的浓度极低且极易水解，与浓度较高的B因子相比性质十分相似，造成对C2进行分离提纯和检测分析的困难［2］ .Polley等［3］ 曾分离到极少量的C2，但纯度不高，且需要人血清白蛋白作为稳定剂.Mayer等［4］ 通过C4包被的致敏红细胞的吸附，得到了稳定的豚鼠C2样品，但不能应用到大规模制备上.我们采用液相色谱等方法成功地从人血清中分离到稳定的C2纯品.
1 材料和方法
1.1 材料 人血浆购自本校西京医院血库.盐酸苯甲脒购自Fluka.Chemie AG公司.Na3 PO4 ，CaCl2 ，EDTA，MgCl2 均购自西安化学试剂厂.（NH4 ）2 SO4 购自天津南开化工厂.巴比妥酸购自北京芳草医药化工研制公司.CM-Sepharose6B，Sephadex G-25和DEAE-Sepharose购自Pharmacia Biotech.电泳仪和色谱仪均购自BIO RAD公司.分光光度仪购自Beckman.
1.2 方法
1.2.1 冷球蛋白沉淀 新鲜血浆500mL，加入20mmol・L-1 CaCl2 ，4℃过夜后，23000g离心15min，取上清，加入5g・L-1 盐酸苯甲脒.
1.2.2 优球蛋白沉淀 上清液（pH5.5）作为透析内液，透析外液为2L含5g・L-1 盐酸苯甲脒的5mmol・L-1 -EDTA（pH5.5），4℃过夜后，透析内液23000g离心30min，取上清，加入20mL0.4mol・L-1 Na3 PO4 （pH6.0），5mL0.2mol・L-1 -EDTA（pH6.0）和0.1mL甲苯.
1.2.3 离子交换色谱 CM-Sepharose6B（20cm×5cm）用0.1mol・L-1 Na3 PO4 （pH6.0）平衡，将样品上柱，用0.4mol・L-1 Na3 PO4 （pH6.0）洗脱，流速4.2mL・min-1 ，流动相中均含5g・L-1 盐酸苯甲脒.回收活性成分.
1.2.4 硫酸铵沉淀 活性成分中按291g・L-1 加入（NH4 ）2 SO4 使其终浓度为500g・L-1 ，4℃搅拌，23000g离心30min.上清液过滤后，按159g・L-1 再加入（NH4 ）2 SO4 使其最终浓度为750g・L-1 ，30000g离心90min，弃上清.沉淀中加入25mL含5g・L-1 盐酸苯甲脒的0.4mol・L-1 Na3 PO4 （pH6.0），过夜使其再溶，30000g离心30min，取上清.
1.2.5 亲和色谱 ①CNBr活化的Sepharose4B的合成:将3.5g CNBr溶解在3.5mL二甲基甲酰胺中，加入25mL Sepharose4B胶，将pH值调至10～11，20℃搅拌.用0.1mol・L-1 Na3 PO4 （pH7.8）充分冲洗，并在100mL相同的缓冲液中，4℃搅拌过夜.②上柱:Sephadex G-25（20cm×2.6cm）用巴比妥缓冲液（5mmol・L-1 Veronal，0.5mmol・L-1 CaCl2 ，2.0mmol・L-1 MgCl2 和0.04mol・L-1 NaCl，pH8.5）平衡，将样品上柱，收集活性峰.CNBr活化的Sepharose4B（15cm×1cm）用上述缓冲液平衡后上样，用0.4mol・L-1 Na
3 PO4 （pH6.0）洗脱，流速1.0mL・min-1 ，收集活性峰.
1.2.6 离子交换色谱 CM-Sepharose6B（5cm×1cm）用0.1mol・L-1 Na3 PO4 （pH6.0）平衡，将样品稀释4倍后上柱，用0.4mol・L-1 Na3 PO4 （pH6.0）洗脱，收集活性峰100mL，-20℃冻存.
1.2.7 SDS-PAGE电泳 浓缩胶浓度为40g・L-1 ，分离胶浓度为75g・L-1 .其他同常规SDS-PAGE电泳.
1.2.8 C2活性测定 将0.5mL C2稀释后，与0.5mL抗体、C1和C4致敏的红细胞（108 ・mL-1 ）30℃共育5min;再将1.5mL豚鼠血清用0.04mol・L-1 EDTA稀释30倍，加入以上混合液，37℃孵育1h，1000g离心10min.然后加入5mL冷藏的0.15mol・L-1 NaCl，根据上清的A410 值判断溶血活性［5］ .
1.2.9 Lowry法测定蛋白量 用0.5mg・mL-1 的BSA作标准曲线，其他同常规Lowry法.
2 结果
优球蛋白沉淀后的样品上CM-Sepharose6B（20cm×5cm）柱（Fig1），收集之活性峰（pool）上CNBr活化的Sepharose4B柱（Fig2）和再收集之活性峰上CM-Sepharose6B（5cm×1cm）柱（Fig3）的C2色谱图.经SDS-PAGE电泳（Fig4）证实条带单一的C2条带，最终测得比活为17.34×1016 nKat・g-1 ，C2的蛋白含量为2.49mg・L
-1 .
3 讨论
C2是一种β球蛋白，相对分子质量Mr 100000，单链，含糖159g・L-1 ，沉降系数为4.5S.C2的一级结构已经阐明，共有732个氨基酸.人C2基因位于6p31.2，全长18kb，与另外3个补体蛋白B因子、C4a和C4b的基因紧密相关［6］ .C2极易被C1s裂解为C2a和C2b，其相对分子质量分别为Mr 70000和30000，C2a构成经典激活途径中C3转化酶的酶原部分，而C3的活化是补体激活的关键步骤，它导致靶细胞最终被膜攻击复合物溶解［5］ .C2b生物活性至今不明［1］ .为了明确C2的功能及其与某些疾病的关系，首先要得到纯度高、稳定性好的C2纯品.
图3 － 图4 略
为保持生物学活性、减少操作步骤、增加产率等原则，我们采用沉淀、透析、盐析等方法，利用亲和色谱提纯倍数高、离子交换色谱容量高等优点，实现了对C2较好的分离［7］ .其中用优球蛋白沉淀除去了C1，用CM-Sepharose6B柱和硫酸铵沉淀除去了血清中的白蛋白.C2与B因子性质相似，但浓度仅为20mg・L-1 ，比B因子低10倍，B因子直接导致C2的产率降低.实验中利用CNBr活化的Sepharose 4B柱在低盐环境中（0.1mol・L-1 Na
3 PO4 ）可与C2特异性结合，在高盐环境中（0.4mol・L-1 Na3 PO4 ）被洗脱的特点［8］ ，成功地除去大部分B因子.C2裂解片段是提纯过程中的另一种污染物，通过反复加入盐酸苯甲脒，特别是在纯化早期，有效地抑制了C2蛋白的水解.我们对
参考文献
中的几种方法进行综合、简化并加以改进，得出具体的纯化步骤.实验结果也表明:在离子交换色谱及亲和色谱中用等浓度洗脱比文献中用梯度洗脱所需的时间短，仪器简单，分离效果好.最后，经Lowry法检测，本实验从1000mL血浆中提纯到了2.49mg C2，与其血浆浓度相比，产率为12.46%.总活性是43.3nKat×1013 ，比活为17.34nKat×1016 ・g-1 ，与1000mL血浆中C2总活性31.7nKat×1014 相比，活性回收率为13.68%.实验中的回收部分由电泳证实，最终所得活性峰由电泳和活性测定得到证实.终产物在pH中性时稳定，且无需加入蛋白稳定剂.方法简便，产率较高，适用于实验室研究和大规模制备.
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