【关键词】 黑色素瘤抗原基因
关键词: 抗原肽;黑色素瘤抗原基因;肝癌
0 引言
寻找和鉴定肿瘤抗原肽是肿瘤免疫研究中的重要任务.人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）可通过特异性识别与人类HLA分子结合的肿瘤抗原决定簇而介导肿瘤抑制，用这些肽支撑的疫苗可以预防或治疗肿瘤［1］ .寻找和鉴定肝癌细胞表面表达的抗原肽对肝癌治疗有重要意义.目前这方面报道很少.本实验用细胞膜温和酸洗、液质联用技术分析了人肝癌细胞系HHCC细胞膜表面表达的抗原肽.并用RT-PCR的方法在mRNA水平上分析了该抗原肽编码基因的表达.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株HHCC购于上海动物细胞所.反相C18柱为Nobel公司产品.TRIZOL，逆转录试剂盒等购自Gibeco公司.小量质粒提取试剂盒等购自上海华舜生物公司.
1.2 方法
1.2.1 温和酸洗法获得HHCC细胞膜抗原肽 大量培养HHCC至1×109 /瓶细胞.以pH3.3柠檬酸钠室温条件下酸洗，共收集1×1010 个细胞的上清液，将上清液过Sephadex（15mm×500mm）凝胶柱，紫外分光光度法定量后，反相C18柱分析HHCC酸洗成分，HP5998C型电离子喷雾质谱仪上进行反相-高效液相色谱质谱联用（PR-HPLC-MS）鉴定活性成分.
1.2.2 氨基酸同源性分析 用BLASTP软件，对互联网NR数据库进行检索，寻找同源性氨基酸序列.
1.2.3 提取细胞株HHCC mRNA并反转录获得编码序列、克隆测序 PCR引物根据GenBank中MAGE-1基因设计，引物1:5’-CGG AAT TCA TGT CTC TTG AGC AGA GGA GTC-3’，引物2:5’-CGA AGC TTT CAG ACT CCC TCT TCC TCC TCT-3’，用EcoRⅠ，HindⅢ两个酶切位点，克隆入载体pUC19，测序. 2 结果
细胞膜酸洗肽的质谱分析一个CAD图的手工解析结果为EPVTKAEML，用BLAST软件分析的结果为该9肽为黑色素瘤相关抗原基因（MAGE）基因编码，为MAGE-1抗原的第121～129位氨基酸.用RT-PCR对HHCC细胞株进行扩增，获得一长度为900～1000bp长度片段（图1），克隆入载体后酶切鉴定与RT-PCR产物长度一致.DNA测序后与GenBank报道的MAGE-1100%同源性（图2），该抗原肽位于121～129位氨基酸（图3）.
核苷酸序列全长930bp，与GenBank公布的MAGE-1基因序列完全一致，划线序列为核酸内切酶酶切位点.
3 讨论
近年来质谱法已成为蛋白质研究的主要技术之一，高效液相色谱质谱联用技术是研究HLA结合肽的一个很好手段［2，3］ .本实验采用酸洗的方法直接从肝癌细胞HHCC细胞膜上洗脱多肽，酸洗液经分离和浓缩、反相-高效液相色谱、反相高效液相色谱质谱联用技术分析酸洗液多肽成分，得到一个9肽序列EPVTKAEML，BLASTP同源性分析其为MAGE基因编码，位于MAGE-1抗原的第121～129位氨基酸，目前还未见关于该9肽的其他报道.随后对HHCC细胞进行RT-PCR，确实得到了MAGE-1基因，与GenBank报道的序列一致，未发现有任何突变，从而证实了酸洗技术和液质联用技术的可靠性，为寻找、分析肿瘤抗原肽提供了新的途径.关于其抗肿瘤免疫效应的体内、体外实验目前正在研究之中.
图1 － 图3 略
参考文献
［1］Marchand M，van Baren N，Weynants P et al.Tumor regres-sion observed in patients with metastic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3and presented by HLA-A1［J］.Int J Cancer，1999;80（2）:219-230.
［2］Maffer A，Haris PE.Peptides bouned to majorhistocomplatible complex molecules ［J］.Peptides，1998;79（1）:179-198.
［3］Heynes PA，Fipp N，Sebersold R et al.Identification of gel-seperated proteins by liquidchromatrgraphy-electrospray tandem mass spectrometry:Comparision of methods and their limitions ［J］.Electrphoresis，1998;19（6）:930-945.转贴于