关于红藻氨酸诱导大鼠癫痫发作时海马mGluR5mRNA表达变化的动态观察

作者：江文　黄远桂　王洪典　肖华胜　高华

【关键词】 谷氨酸受体
　　关键词: 谷氨酸受体;癫痫;海马;红藻氨酸;脑电图
　　摘 要:目的 探讨红藻氨酸（KA，10mg・kg-1 ）诱导大鼠癫痫发作时海马代谢型谷氨酸受体5亚型（mGluR5）mRNA表达变化的病理特征. 方法 采用同位素S35 dATP标记寡核苷酸探针原位杂交法检测大鼠癫痫发作前后海马mGluR5mRNA的表达变化，通过图像分析系统进行定量处理.同时观察大鼠行为学及脑电变化. 结果 KA注射后大鼠均出现严重边缘性惊厥，脑电图表现为阵发性癫痫样放电.正常大鼠海马中有丰富的mGluR5mRNA表达，以齿状回和CA1区表达较高.KA注射后海马各区mGluR5mRNA表达呈时间依赖性下调，CA1，CA3，CA4区表达在2h呈现出显著性差异（P&<0.05），齿状回区表达在1h即有显著性差异（P&<0.01），至72h各区表达均至最低. 结论 mGluR5在癫痫发作后表达下降可能有助于限制神经元网络的异常兴奋性，使细胞发挥自身保护性作用.

　　
　　Abstract:AIM To investigate temporospatial changes of metabotropic glutamate receptor subtype5（mGluR5）mRNA expression in rat hippocampus during seizures induced by　kainic acid（KA）.METHODS Using in situ hybridization with S35 dATP-labelled oligodeoxyribonucleotide probes，mGluR5mRNA expression was examined.The relative num-ber of hybridization signals was quantified by image analysis systems.The electroencephalogram（EEG）and behaviour changes of the rats were simultaneously observed.RESULTS All rats of KA-injected group exhibited severe limbic con-vulsions.The EEG recordings also showed electrical seizure activities.mGluR5mRNA was widely expressed in rat hip-pocampus with the higher levels in the granular layer of the dentate gyrus and the pyramidal layer of CA1.After KA in-jection，mGluR5mRNA expression exhibited time-dependent downregulation.Area scanning revealed that mGluR5mRNA was markedly downregulated at2h in CA1，CA3and CA4（P&<0.05），but in dentate gyrus at1h（P&<0.01）.At72h，it reached the lowest level.CONCLUSION KA-induced seizures modifies mGluR5gene expression，which may help to limit abnormal excitability of neuronal network.
　　
　　0 引言
　　
　　代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的发现是谷氨酸能突触研究的一项重要进展.到目前为止，已经克隆出8种mGluRs亚型（mGluR1-8），依据序列的同源性、信号转导机制以及激动剂的选择性，可以将其分为3组，Ⅰ组包括mGluR1和mGluR5，Ⅱ组包括mGluR2和mGluR3，Ⅲ组包括mGluR4，6，7，8.Ⅰ组受体与磷脂酶C（PLC）耦联，激活后促使磷脂酰肌醇（PI）水解，产生三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG），IP3使内质网中Ca2+ 释放到胞质中，导致胞质中Ca2+ 浓度增高，DAG则可激活蛋白激酶C（PKC），增强NMDA受体介导的兴奋毒性［1］ .研究表明，Ⅰ组受体激动剂可以产生致痫作用，其拮抗剂可阻断多种实验性癫痫的发生，提示Ⅰ组受体在癫痫活动中发挥了重要作用［2，3］ .以往多用药理学方法研究mGluRs的作用，而有关癫痫发作期间特定脑区mGluRs mRNA表达水平的动态观察研究较少.为此，我们采用红藻氨酸（KA）诱导大鼠癫痫发作模型，动态观察致痫前后海马Ⅰ组mGluR5亚型mRNA的表达变化，同时观察大鼠行为学和脑电图（EEG）表现，以期从分子水平进一步探讨癫痫的发生机制.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 雄性SD大鼠34只，体质量200～250g，随机分为对照组、KA注射后1，2，4，8，24和72h等7个实验组，每组4只大鼠，共28只.KA（Sig-ma公司）腹腔注射10mg・kg-1 ，对照组生理盐水腹腔注射.6只大鼠用于描记EEG.所有大鼠均观察行为学变化.
　　
　　1.2 方法 ①EEG描记及组织切片制作:用原方法［4］ ;②探针标记:mGluR5寡核苷酸探针序列［5］ 为5’-GGAGCGGAAGGAAGAA GATCCATCTACA-CAGCGTAC CAAACCTTC-3’（由上海生物工程有限公司合成）.运用3’-末端标记法标记探针.将5μL S35 dATP，2μL10×Cobalt Reaction Buffer，4μL（20ng・μL-1 ）mGluR5寡核苷酸探针、1μL末端转移酶、8μL灭菌水混合后，37℃水浴2.5h.选用Nensorb20TM 核酸纯化柱纯化探针.探针标记效率为2.5GBq・L-1 .③原位杂交:杂交前取出脑片，风干.40g・L-1 多聚甲醛固定20min，0.1mol・L-1 冲洗2次，每次5min，4×SSC+1×Denhardt’s浸洗1h，依次进行700，900和1000mL・L-1 乙醇脱水各3min，氯仿脱脂10min，室温中晾干.杂交液组成:500mL・L-1 去离子甲酰胺，4×SSC，1×Denhardt’s，0.02mol・L-1 Na3 PO
4 ，10mL・L-1 N-lauroysarcosine，10g・L-1 硫酸葡聚糖，100mmol・L-1 二硫苏糖醇，50mg・L-1 鲑鱼精子ssDNA和变性的S35 标记的探针（1.25GBq・L-1 ）.将杂交液混匀，每张脑片滴加50μL，42℃孵育24h.杂交后4×SSC冲洗10s，1×SSC室温洗20min，1×SSC55℃洗3次，每次20min.之后脱水，干燥，进行放射自显影.将载玻片浸入NT B2乳胶稀释液中，按浸膜法涂布乳胶，干燥后将载玻片储存于暗盒中，4℃曝光6wk.最后用D-19显影液显影，F-5定影液定影，中性红衬染，封片、观察.对照试验包括空白对照（a）:部分切片在杂交液中省去标记探针进行杂交;竞争试验（b）:部分切片在杂交液中加入标记探针和200倍的未标记探针进行杂交.④统计学处理:原位杂交结果在明视野显微镜下认定结构部位后，经Leica真彩色图像分析系统在853.52μm2 标准框下对阳性信号进行面积扫描.实验结果以均值±标准差表示.采用SPLM统计软件进行多组均数的方差分析，NOSA软件作复式条图.
　　2 结果
　　
　　2.1 大鼠行为学表现 KA腹腔注射后，大鼠立即出现凝视，不动，至15～30min后开始表现为湿狗样运动，40～60min后出现自动症及轻度边缘性惊厥，70～90min后出现严重边缘性惊厥状态，表现为流涎、姿势失衡、肢体阵挛等.持续至3h左右，症状开始减轻，之后惊厥呈阵发性发作.
　　
　　2.2 大鼠EEG变化 KA注射后2～5min，海马及皮质均出现癫痫样波发放，30min内癫痫样波呈阵发性出现，30min之后呈持续性.其放电波形多样，以棘波、慢波、棘慢波、慢波叠加棘节律等波形为主（Fig1）.盐水注射后，未见癫痫样波发放.
　　
　　图1 略
　　
　　2.3 mGluR5mRNA表达的时程变化 原位杂交微观放射自显影显示，正常大鼠海马中有丰富的mGluR5mRNA表达，以齿状回和CA1区表达最高.KA注射后各时间点均呈时间依赖性下调趋势（Fig2）.面积扫描发现:齿状回、CA1，CA3，CA4区mGluR5mRNA表达于KA注射后逐渐下调，CA1，CA3，CA4区表达在2h呈现出显著性差异（P&<0.05），齿状回区（DEN）表达在1h即有显著性差异（P&<0.01），各区均在72h表达最低（Fig3）.空白对照及竞争试验结果均为阴性.
　　
　　3 讨论
　　
　　KA诱导的大鼠癫痫发作表现，发作相关性脑损害以及发作的易感性都极其类似于人类颞叶癫痫，因此KA模型被广泛用于复杂部分性发作研究［6］ .我们从大鼠行为学表现以及深部电极脑电图方面进一步证实了KA模型的可靠性. 转贴于 　　图2 － 图3 略
　　
　　KA诱导大鼠癫痫发作的具体机制目前仍不十分清楚，但总的来说不外是脑内兴奋与抑制失平衡所致，谷氨酸作为脑内其中一种兴奋性神经递质，在癫痫发作中扮演了重要角色.其作用的发挥主要通过两类受体来介导，一类是离子型受体，包括NMDA，AMPA和KA受体，另一类是代谢型受体，包括mGluR1-8.有关癫痫状态下离子型谷氨酸受体mR-NA的表达变化既往已有报道［7］ .我们着重观察了mGluR5mRNA在癫痫发作后的时、空表达特征，结果表明，在癫痫状态下，海马各区包括齿状回，CA1，CA3，CA4区mGluR5mRNA的表达均呈时间依赖性下调，提示这些区域对癫痫活动较敏感，同时基因表达易受惊厥活动调控.
　　
　　mGluR5与mGluR1一样均属于I组mGluRs，与G-蛋白耦联，调节细胞膜上离子通道以及胞浆内第二信使的表达.我们发现，在大鼠海马内mGluR5 mRNA有丰富的表达，其中以齿状回、CA1区表达最高，与国外文献报道基本一致［5］ .既往免疫组化研究也观察到大鼠海马具有丰富的mGluR5免疫阳性神经元［8］ ，提示在海马谷氨酸能突触传递过程中，mGluR5可能扮演了一个重要角色.
　　KA诱导大鼠癫痫发作过程中，mGluR1mRNA在最初的数小时内表达增强，之后表达逐渐下降［4］ ，而mGluR5mRNA表达与之不一样，KA注射后mGluR5mRNA的表达一直呈现出逐渐下调的趋势，至2h已有显著性差异，其中以齿状回最为明显.72h表达最低.提示在癫痫发作时，海马神经元对谷氨酸的反应性不一样.神经元通过调节不同的基因表达，一方面来促进兴奋毒性损害，另一方面又限制兴奋毒性损害.癫痫发作后，mGluR5和mGluR1mRNA的表达不同，暗示着mGluR5和mGluR1在癫痫发作过程中可能扮演了不同的角色.
　　其他类型GluRs mRNA在癫痫发作中的表达既往也有研究，Pratt等［9］ 在快速点燃模型研究中发现NMDA受体各亚基mRNA于惊厥后不同时间表达发生改变，NR1mRNA在完全点燃后2h内无变化，4h表达量增加，随后下降;NR2A，NR2B mRNAs的水平在点燃4h后分别增加102%和46%.Fried-man等［7］ 在红藻氨酸致痫模型中发现NMDA受体亚基基因在惊厥后未发生改变，而AMPA/KA敏感的谷氨酸受体Glu2，Glu3mRNAs在CA3，CA4区明显降低，齿状回中Glu2，Glu3mRNAs的表达则增加.提示不同的致痫因素引起谷氨酸受体mRNA的表达出现不同的改变，同一致痫因素引起的改变也具有基因选择性以及时间和空间上的选择性.
　　
　　Akbar等［10］ 在杏仁核点燃模型中发现，mGluR5mRNA于惊厥后24h表达出现变化，在齿状回，CA1，CA3，CA4区均出现了显著性降低.本研究结果与之类似，其在癫痫发作早期表达下降与惊厥活动有关，可能是致痫因素启动癫痫发作后，又导致内源性抗痫系统的激活，促进mGluR5表达下降.晚期表达下降则与神经元的变性、死亡又有关系.由于mGluR5与PLC通路耦联，可以调节细胞内Ca2+ 浓度以及细胞膜上离子通道的活性，在谷氨酸过量释放的情况下，其表达下降有助于限制神经元网络的异常兴奋性，使细胞发挥自身保护性作用.在癫痫发作早期，大鼠脑内通过何种具体通路来影响mGluR5的表达，目前仍不清楚.近年来大量研究发现，癫痫发作后谷氨酸通过激活其受体导致细胞外Ca2+ 内流以及即刻早期基因如c-fos，c-jun等快速短暂的表达，c-fos，c-jun等作为转录因子又可诱导或抑制下游分子的表达［11］ .因此我们推测，mGluR5mRNA在癫痫发作早期表达的减少可能与这些因素又有关.但mGluR5蛋白表达的变化是否与基因表达变化一致，仍有待于进一步研究.
　　参考文献:
　　
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