作者：刘颖格 戚好文 李焕章 苏明权 于文彬 马越云
【关键词】 反义核酸
关键词: myc基因;反义核酸;大鼠;平滑肌
摘 要:目的 观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌增殖的抑制作用. 方法 大鼠气道平滑肌细胞原代培养，4～12代用于实验.利用Lipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠气道平滑肌细胞，MTT法检测不同寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用，RT-PCR检测c-myc mRNA的表达，免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达. 结果 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖，且这种抑制作用呈浓度依赖性;反义c-myc寡核苷酸可降低c-myc mRNA的表达，同时降低了c-myc mRNA的翻译. 结论 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌的增殖.
Keywords:genes，myc;oligonucleotide，antisense;rat;muscle，smooth
Abstract:AIM To observe the antiproliferative effect of c-myc antisense oligonucleotide on rat airway smooth muscle cells.METHODS Rat airway smooth muscle cells were pri-mary cultured.4～12passages were used in experiments.Lipofectin was used to transfect antisense oligonucleotide，sense oligonucleotide and mismatched oligonucleotide for c-myc to rat airway smooth muscle cells.The antiproliferative effect was assayed by way of MTT.RT-PCR was used to de-tect the expression of c-myc mRNA.c-Myc was observed by immunohistochemistry staining.RESULTS Antisense oligonucleotide for c-myc could inhibit the proliferation of rat airway smooth muscle cells，and this effect was related with concentration.Antisense oligonucleotide for c-myc could de-crease the expression of c-myc mRNA.The translation of c-myc was also decreased.CONCLUSION Antisense oligonucleotide for c-myc could inhibit the proliferation of rat airway smooth muscle cells.
0 引言
气道重塑（airway remodelling）在哮喘发病过程中有重要作用，包括气道上皮和气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMC）的增殖［1］ .原癌基因是各种细胞内信号转导的最后共同通道，是参与气道重塑的重要因素.我们拟利用反义c-myc寡核苷酸阻断细胞增殖，达到抑制ASM增生、缓解气道重建的目的.
1 材料和方法
1.1 材料 主要试剂及仪器:Ⅳ型胶原酶、兔抗鼠actin抗体、MTT:Sigma公司;DMEM，Lipofectin，TRIZOL:Gibcobrl公司;胎牛血清:杭州四季青生物制品工程公司;Access RT-PCR试剂盒:Promega公司;核酸水平电泳仪:美国BIO-RAD公司;反义、正义及错配c-myc寡核苷酸由美国Genemed Synthe-sis，Inc.合成，其核苷酸序列分别如下:5’CAC GTT GAG GGG CAT3’，5’CAC GTG GAG TGG CAT3’和5’ATG CCC CTC AAC GTG3’，每条寡核苷酸的末端两个碱基间行硫代修饰.另合成5’端FITC标记的反义c-myc寡核苷酸.
1.2 方法
1.2.1 大鼠ASMC的分离与培养 健康、雄性SD大鼠1只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量260g，脊椎脱臼法处死，无菌剥离气管及气管内、外膜，剪碎剩余组织块约为1mm×1mm×1mm大小，2g・L-1 Ⅳ型胶原酶37℃消化2次，每次30min，中间吹打组织块1次，100目不锈钢滤网过滤.100mL・L-1 胎牛血清高糖DMEM培养.
1.2.2 ASMC的纯化 经原代培养后，细胞呈多克隆生长，选择细胞形态呈梭形的克隆在倒置显微镜下机械分离.分离所得细胞继续培养1代，2.5g・L-1 胰酶短暂消化，1∶3传代，静置细胞30min，去除未贴壁细胞，利用平滑肌细胞容易贴壁的特性进一步纯化所得细胞.
1.2.3 大鼠ASMC的鉴定 ASMC离体培养时呈梭形，有较长的突起，细胞核位于细胞中央，排列成旋涡状、放射状或栅栏状.培养细胞经SABC免疫组织化学鉴定.取4～12代于对数生长期的细胞用于实验.
1.2.4 反义c-myc寡核苷酸导入细胞的证实 按1×107 ・L-1 接种细胞，48h后导入FITC标记的反义c-myc寡核苷酸（2mg・L-1 ），继续培养9h，弃培养液，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜下观察反义c-myc寡核苷酸进入细胞内情况.
1.2.5 反义c-myc寡核苷酸与Lipofectin不同比例的实验观察 实验步骤如上，分别观察反义c-myc寡核苷酸与Lipofctin的质量比为2∶0，2∶1，2∶5，2∶10及2∶20时的转染效果，确定后续实验二者最佳比例.
1.2.6 反义c-myc寡核苷酸对大鼠ASMC增殖抑制实验 2.5g・L-1 胰酶消化于对数期生长的ASMC，调整细胞数为5×107 ・L-1 ，每孔接种100μL，每4孔为1组，MTT法观察1，2和3mg・L-1 的反义c-myc寡核苷酸对大鼠ASMC的增殖抑制作用1～6d.
1.2.7 反义c-myc寡核苷酸抑制ASMC c-myc mR-NA表达的实验 以2mg・L-1 的反义c-myc寡核苷酸处理100mL培养瓶中于对数期生长的ASMC72h，1mL TRIZOL匀质化，加入0.2mL三氯甲烷，震摇数秒后于4℃12000g离心15min，上清液加入0.5mL异丙醇沉淀RNA，4℃，12000g离心10min，1mL750mL・L-1 乙醇洗涤RNA沉淀1次，4℃，7500g离心5min，室温下挥发乙醇，50μL无核酶水溶解总RNA;RT-PCR反应系统如下:总RNA1μL，AMV/Tfl反应缓冲液10μL，dNTP（10mmol・L-1 ）1μL，引物各1μL，25mmol・L-1 MgSO4 2μL，AMV反转录酶（83.4mkat・L-1 ）1μL，Tfl DNA聚合酶（83.4mkat・L-1 ）1μL，总体积50μL.引物序列如下:5’TAC TCA CCA GCACAA TTA TG3’，5’TTG AAC GGA CAG GAT GTA GG3’，扩增产物315bp，PCR内参照选用大鼠β-actin，引物序列如下:5’GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C3’，5’AGC CGC CGT CCC GTC AAG TCA G3’，扩增产物323bp.扩增程序如下:48℃45min反转录，94℃2min，AMV反转录酶失活，RNA/cDNA链打开，94℃变性30s，60℃退火1min，68℃延伸2min，共30循环，末次循环68℃延伸7min.PCR产物经20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.8 反义c-myc寡核苷酸抑制ASMC c-Myc蛋白表达的实验 反义c-myc寡核苷酸（2mg・L-1 ）处理于对数期生长的ASMC72h，细胞爬片经2次PBS洗涤，950mL・L-1 乙醇固定10min，标准SABC法行免疫组织化学染色:PBS漂洗2次，每次5min;入7.5mL・L-1 h3 O2 -PBS37℃，30min，阻断内源性过氧化物酶;PBS漂洗2次，每次5min;滴加正常山羊血清，37℃保温30min，消除非特异染色;弃封闭血清后加兔抗鼠c-Myc（工作浓度1∶200），37℃保温50min;PBS漂洗3次，每次3min;加生物素化山羊抗兔IgG（工作浓度1∶200），37℃保温30min;PBS漂洗3次，每次3min;加入ABC复合物，37℃保温30min;PBS漂洗3次，每次3min;DAB显色10min，水洗5min，苏木精复染，逐级脱水、透明、封片.以正常兔血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗和二抗，行替代对照和空白对照.
统计学处理:数据经SPSS软件分析，组间比较采用单因素ANOVA检验.
2 结果
2.1 大鼠ASMC的鉴定 大鼠ASMC actin染色结果如Fig1所示.actin主要分布于细胞质内.
2.2 反义c┐myc寡核苷酸导入细胞的证实 经FITC标记的反义c-myc寡核苷酸与平滑肌细胞共培养9h后，细胞核有明亮的荧光染色，部分细胞核核仁染色突出，细胞质亦有染色（Fig2）.
2.4 反义c┐myc寡核苷酸对大鼠ASMC的增殖抑制作用 导入1，2和3mg・L-1 的反义c-myc寡核苷酸对ASMC细胞均有抑制作用，这种抑制作用随反义寡核苷酸的浓度增加而增强（Fig3）. 2.5 反义c┐myc寡核苷酸抑制ASMC c┐myc mRNA的表达 2mg・L-1 的反义c-myc寡核苷酸处理
ASMC72h后，c-myc mRNA表达量明显减少（Fig4）.
图1 － 图4 略
2.6 反义c┐myc寡核苷酸抑制ASM c┐Myc蛋白表达 反义c-myc寡核苷酸导入平滑肌细胞72h后，c-Myc表达量显著下降（Fig5）.
3 讨论
哮喘反复发作可致气道重塑，多种炎症介质在此过程中发挥作用［1，2］ ，其中包括表皮生长因子、转化生长因子、白细胞介素-4，5（interleukin-4，5，IL-4，5）等.原癌基因是这些炎症因子mRNA转录前必须转录的早期基因，是信号转导过程中的最后共同通道［3］ .c-Myc是启动细胞周期、促使细胞分裂的重要核转录因子［4］ ，c-Myc上存在DNA结合序列CACGTG［5］ .几乎所有增殖的细胞都有c-myc表达，静止细胞表达较低，快速增殖细胞表达程度较高.c-Myc蛋白的过量产生，可使一些细胞对生长因子的依赖性减少，导致细胞永生化并失去分化功能［6］ .
反义技术依据核酸杂交原理，使反义核酸与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的生产.本实验将FITC标记的反义c-myc寡核苷酸导入大鼠ASMC，细胞核染色较深，核仁染色明亮，说明反义c-myc寡核苷酸确实进入细胞核内并与核内核酸结合.Lipofectin增加了细胞对反义c-myc寡核苷酸的摄取，硫代修饰的反义c-myc增强了寡核苷酸的稳定性［7］ .实验发现反义c-myc寡核苷酸可以抑制大鼠ASMC增殖，且这种抑制作用从反义c-myc寡核苷酸导入细胞的第1日开始就表现的较为明显，并持续到第7日.同时，我们发现反义c-myc寡核苷酸的这种抑制作用具有浓度依赖性，随浓度的增加，抑制作用明显增加.RT-PCR结果显示反义c-myc寡核苷酸可减低细胞内c-myc mRNA的表达，对照组、错配组及正义组寡核苷酸均无此作用，表明反义c-myc寡核苷酸抑制c-myc mRNA的表达具有特异性.免疫组织化学染色显示，在c-myc mRNA的表达减少的同时，c-Myc蛋白的表达量也同时降低，这与张浩等［8］ 的研究结果相同.反义c-myc寡核苷酸抑制细胞增殖的可能机制是反义c-myc寡核苷酸封闭了c-myc mRNA的翻译起始部位.本实验设计的反义c-myc寡核苷酸包含AUG结构，这一设计使c-myc mRNA的翻译明显降低，从而降低了与Max蛋白的结合量，继而降低了与DNA序列CACGTG的结合，减少了细胞内多种细胞周期蛋白的表达［9］ .RT-PCR结果从另一方面支持了这一理论.反义c-myc寡核苷酸抑制细胞增殖的另一机制是其激活了细胞内RNA酶（如Rnase H等），从而加速mRNA降解，降低c-Myc蛋白的表达.免疫组织化学染色研究显示，反义c-myc寡核苷酸导入细胞内72h后，c-Myc表达明显降低，说明了这一假说的可能性，但反义c-myc寡核苷酸抑制细胞增殖的详细机制仍待进一步研究.
图5 略
反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠ASMC增殖，抑制c-myc mRNA的翻译及表达，虽然其详细作用机制还不明了，但它已表现出一定的临床应用前景［10］ ，可能为延缓支气管哮喘患者气道重塑提供一种新的疗法.
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