作者：韩苇 颜真 王俊楼 赵永同 石继红 张英起
【关键词】 ，模拟肽
关键词: 模拟肽;基因表达;大肠杆菌
摘 要:目的 克隆和表达EPO模拟肽基因4串联体. 方法 设计了特殊的基因串联方案，在人工合成EPO模拟肽全基因的基础上，将EPO模拟肽基因由单体逐步地连接成4串联体.继而将获得的正确EPO模拟肽4串联体插入pBV220表达载体诱导表达. 结果 构建的EPO模拟肽基因4串联体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因串联体的序列与设计的序列完全相同.EPO模拟肽4串联体插入pBV220载体后，重组菌经42℃诱导4h，SDS-PAGE分析结果显示，该串联体得到较高水平的表达.凝胶扫描结果表明，其表达量约占菌体蛋白总量的20%. 结论 EPO模拟肽基因4串联体的构建与表达均获得了成功.
Keywords:mimetic peptide;gene expression;Escherichia coli
Abstract:AIM To clone and to express4repeats of EPO mimetic peptide gene.METHODS Whole EPO mimetic pep-tide gene was synthesized and inserted into pBS cloning vec-tor.Multiple repeats of EPO mimetic peptide gene was grad-ually obtained with a new construction method.Then the correct gene repeats was transfered to EcoRI and BamHI sites of pBV220expression vector.RESULTS The sequencing and restriction analysis showed that4repeats of EPO mimetic peptide gene was correctly connected and was cloned into pBV220vector.After the recombinant bacteria was induced at42℃for4h，a new anticipated protein band with relative molecule mass of12ku was found on SDS-PAGE gel.The protein band amounted to20%of total bacteria protein.CONCLUSION The correct4repeats of EPO mimetic pep-tide gene has successfully been constructed and expressed in E.coli.
0 引言
EPO模拟肽是Wrighton等［1］ 在1996年采用噬菌体表面呈现技术在肽库中筛选出来的20肽，其分子量远小于EPO的分子量，但是其生物学功能与EPO基本相同，是一个具有潜在应用价值的小活性肽.由于EPO模拟肽较小，故直接用于表达有较大困难.我们拟采用特殊的构建方法，将EPO模拟肽基因串联起来，构建该基因的4串联体后表达该串联体，以增加其稳定性和表达量，探讨构建和表达基因串联体的新途径.
1 材料和方法
1.1 材料 ①质粒和工具酶:pBS（多克隆位点的SpeI和XbaI已去除）、pBV220等质粒和DH5α菌株均为本中心保存.限制性内切酶、连接酶均为GiBco公司和上海生物工程公司产品.②EPO模拟肽基因序列的设计与合成:根据文献［1］报道的EPO模拟肽（EMP1）序列，选择大肠杆菌高频密码子设计合成该基因序列，EPO模拟肽合成全基因序列如下:在基因的两端加入了EcoRI，XbaI，BamHI和NheI限制性内切酶位点，以便于构建串联体和克隆.在NheI位点后和XbaI位点前加入了蛋氨酸密码子，以便于表达串联体之后将其裂解为单体.DNA合成由上海生物工程公司完成.
1.2 方法 ①基因重组:质粒DNA的提取、酶切、片段回收、连接和转化均参照文献［2］进行.②SDS-PAGE:胶浓度为150g・L-1 ，取1mL培养菌液离心收集菌体，加2×上样缓冲液煮沸，离心后上样电 EcoRIXbaI5’AATTC ATG TCT AGA ATG GGT GGT ACT TAC TCT TGC CAC TTC GGT CCG CTG ACT TGG GTT TGCG TAC GAG TCT TAC CCA CCA TGA ATG AGA ACG GTG AAG CCA GGC GAC TGA ACC CAA ACG NheIBamHI AAA CCG CAG GGT GGT ATG GCT AGC TAG3’TTT GGC GAC CCA CCA TAC CGA TCG AT CC TAG 泳，电泳毕以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察结果.③DNA测序:均采用PE公司377型全自动序列分析仪进行.④EPO模拟肽基因4串联体的构建:将合成的EPO模拟肽全基因片段溶解于适量水中，在65℃水浴加热10min后缓慢降至室温.退火的DNA片段与经EcoRI和BamHI酶切的pBS质粒DNA连接和转化，挑取重组菌落提取DNA，以XbaI酶切初步鉴定后进行DNA测序.将获得正确序列的质粒命名为pBSEPOM1 ，取此质粒DNA两份，一份用NheI和ScaI酶切后电泳回收小片段;另一份用XbaI和ScaI消化后电泳回收大片段.将上述回收的两个酶切片段连接后转化，提取DNA经测序确定正确重组克隆，此克隆即为EPO模拟肽基因的2串联体，命名为pBSEPOM2 .再用pBSEPOM2 质粒DNA按上述构建pBSEPOM2 的方法操作，即可获得4串联体，命名为pBSEPOM4 （Fig1）.获得的pBSE-POM4 经酶切鉴定和DNA测序确定其序列.⑤EPO模拟肽基因4串联体的表达:将获得的pBSEPOM4 DNA用EcoRI和BamHI酶切后回收小片段（4串联体），与经相同内切酶消化处理的pBV220DNA连接后转化DH5α菌株，提取重组质粒DNA，以EcoRI和BamHI酶切鉴定，得到有插入片段的正确克隆，命名为pBVEPOM4 .将含有pBVEPOM4 的菌液接种于5mL LB培养基中30℃活化过夜，次日按1.5∶100的比例接种于LB培养基中，30℃培养至指数生长中期，迅速转至42℃培养4～5h，离心收集菌体，做SDS-PAGE分析.
2.1 EPO模拟肽基因4串联体的构建鉴定 ①按照设计的方案进行操作，获得了EPO模拟肽4串联体（Fig2）.从图中可见，经EcoRI和BamHI双酶切pBSEPOM4 质粒之后，在约350bp处可见一条清晰的DNA条带，其大小与理论计算值相符.②重组的pBVEPOM4 质粒DNA经双脱氧末端终止法测序（Fig3）.此分析结果证明，本研究构建的EPO模拟肽基因4串联体DNA序列与设计的序列完全相同.
2.2 pBVEPOM4 的表达 含重组pBVEPOM4 的菌株诱导表达后，经SDS-PAGE分析，在42℃诱导后， 含pBVEPOM4 细菌裂解上清中出现了一条分子质量约为12ku的新蛋白带，其分子量大小与理论计算值相符（Fig4）.凝胶经薄层扫描仪扫描，结果表明重组的EPO模拟肽基因4串联体的表达量占菌体总蛋白的20%左右（Fig4）.
图1 － 图4 略
3 讨论
以往构建基因串联体的作者多采用随机串联的方式来获得串联体［3］ ，此种方法的缺点是:偶然性很强，无法人为控制串联体的大小，且往往最终得不到串联体.与之相比，本研究构建基因串联体的方式有所不同，即采用特定的限制性内切酶位点来构建串联体.我们选择了XbaI和NheI两个有相同配伍末端的内切酶，分别将它们设计在EPO模拟肽基因的5’和3’末端，当用XbaI和ScaI酶切pBSEPOM1 质粒时，回收的大片段中含有一个EPO模拟肽基因;当用NheI和ScaI酶切pBSEPOM1 质粒时，回收的小片段中也含有一个EPO模拟肽基因，将此两片段连接
在一起时，由于XabI和NheI两者的配伍末端连接后，该两酶均不能再从连接位点切开DNA，这样就形成了EPO模拟肽基因的2串联体.照此构建方法类推，便可获得4串联体、8串联体、16串联体等.由此可见，我们采用的构建基因串联体的方式的优点在于可以人为地控制串联体的大小.从理论上讲，只要不超出一定的范围，可随意选择构建串联体的大小.本研究基因串联方式的另一个优点是并不完全直接对目的基因本身进行操作，而是将目的基因片段连在载体DNA大片段上来进行串联体的构建，这样就克服了某些小肽因基因过小，难以进行重组操作的困难，故尤其适用于小肽（例如10肽、20肽等）基因串联体的构建.我们采用的构建基因串联体的方式目前在国内外尚未见报道.
我们成功地构建了EPO模拟肽基因4串联体，该串联体在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，为进一步研究该模拟肽奠定了基础，也为构建基因串联体提供了一条新的途径.
参考文献
［1］Wrighton NC，Farrell Fx，Chang R，Kashyap AK，Barbone FP，Mulcathy LS，Johnson DL，Barrett RW，Jolliffe LK，Dower WJ.Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin ［J］.Science，1996;273（5274）:458-463.
［2］Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning.A lab-oratory manual ［M］.2nd.New York:CSH，1989:1.21-1.82，18.47-18.56.
［3］Xiang BY，Yang JH，Chen NC，Shen LQ，Su CZ.Chemical synthesis and cloning of HIV-env26peptide gene ［J］.Chem Biochem J，1990;6（3）:229-233.