纯钛表面聚吡咯涂层的生物安全性分析

【关键词】 牙种植体，聚吡咯，生物安全性，生物相容性材料
　　【Abstract】 AIM: To evaluate the biological safety of polypyrrole film electropolymerized on Tisubstrates for possible use as dental implant. METHODS: The biological safety was evaluated through the experiments including hemolysis test， shortterm systemic toxicity test， oral mucous membrane irritation test and cytotoxicity test (MTT test). RESULTS: The material had no hemolytic activities. The shortterm systemic toxicity test results showed that no histopathological changes were found in the vital organs such as heart， kidney and liver of tested animals. No local response was observed in the oral mucosa membrane irritation test. MTT revealed that L929 cells grew well in the extract and the grade of cytotoxicity was zero. CONCLUSION: The Tisubstrates coated with polypyrrole film have good biological safety.
　　【Keywords】 dental implants; polypyrrole; biological safety; biocompatible materials
　　【摘要】 目的： 评价纯钛表面聚吡咯涂层的生物安全性，为口腔种植体表面改性提供依据. 方法： 分别通过溶血试验、口腔黏膜刺激试验、细胞毒性试验（MTT法）和急性全身毒性试验，初步评价纯钛表面聚吡咯涂层的生物安全性. 结果： 纯钛表面聚吡咯涂层材料无溶血现象，不影响凝血功能；短期全身毒性实验的受试小鼠心、肾、肝的组织切片均未见病理变化；口腔黏膜刺激实验未见异常组织学反应；MTT试验显示L929细胞在涂层浸提液中生长良好，细胞毒性为0级. 结论： 纯钛表面聚吡咯涂层材料具有良好的生物安全性.
　　【关键词】 牙种植体，聚吡咯，生物安全性，生物相容性材料
　　口腔种植修复是目前最具前景的义齿修复手段，如何在种植创愈合初期，促进成骨细胞在种植体表面早期地附着生长，完善地表达其成骨功能是提高种植体与骨组织结合效率的关键. 在纯钛种植体表面固定生物活性大分子能够提高材料的生物相容性，使纯钛种植体既有骨传导作用，又具备骨诱导活性. 然而作为金属材料，纯钛表面不可能同高分子材料一样具有丰富的反应性功能基团来连接侧链、配基或生物活性分子，这成为了制约纯钛种植体表面生物有机修饰的瓶颈［1］. 聚吡咯(Polypyrrole， PPy)，是一种能够表现出半导体和导体的许多光、电、磁特性的导电高分子聚合物，能够在金属表面形成良好的结合［2-3］. 因此，在纯钛表面制备PPy涂层，有望增加其表面的有机修饰活性位点，提高口腔种植手术成功率. 我们利用对纯钛进行表面涂层改性，初步探索其生物安全性，为这一新型材料的后续应用研究奠定基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料6 mo龄新西兰大耳白兔1只，雄性，体质量1.5 kg (第四军医大学实验动物中心)，昆明成年小白鼠16只，体质量18～22 g（第四军医大学实验动物中心），60～70 d金黄色地鼠10只，体质量140～160 g (西安交通大学动物实验中心)，小鼠结缔组织成纤维细胞L929 细胞株（第四军医大学口腔生物实验室），钛材TA2(Ti 西北有色金属研究院)，对甲苯磺酸钠(ToSNa，西安化学试剂厂)，Pyrrole(Py，美国Sigma公司)， 217型KCl饱和甘汞电极(上海化学试剂厂)，ZF5型恒电位仪(上海正方电子电器有限公司)，JSM840型扫描电镜(日本Jeol公司)，BX41型光学显微镜(日本 Olympus公司)，MPSUV260型紫外分光光度仪(日本 岛津公司)，酶联免疫检测仪（美国BioTek公司），DMEM培养液（美国Gibco BRL公司），胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所），胰蛋白酶（上海浦东生化试剂厂），MTT（美国Sigma公司）.1.2方法
　　1.2.1纯Ti表面PPy涂层制备与表面形貌观察将TA2加工成直径18 mm，厚1 mm的圆型试件，金相砂纸从280#逐级打磨至800#. 激光焊接机将直径0.3 mm Ti丝焊接于圆型试件侧面，作为工作电极引线. 采用ZF5型恒电位仪在Ti试件表面恒电流电化学聚合PPy，聚合电流密度控制为1 mA/cm2. 电解液为0.1 mol/L对甲苯磺酸钠、0.1 mol/L Pyrrole水溶液，pH值为4.0左右. Ti试件为工作电极，铂片为对电极，217型KCl饱和甘汞电极为参比电极. 涂层厚度由聚合过程中通过的电量来计算. 每通过100 mC/cm2单位面积的电量大约生成0.28 μm厚度的PPy涂层［4］. PPy涂层厚度均控制为100 μm. 采用JSM840型扫描电镜进行表面形貌观察.
　　1.2.2溶血试验将10个Ti表面PPy涂层试件无菌试管完全浸没于20 mL DMEM培养液中，置于37℃培养箱中72 h，获得浸提液. 心脏穿刺抽取新西兰大耳白兔血10 mL，立即加入20 g/L的草酸钾0.5 mL，抗凝，取8 mL兔血加入10 mL生理盐水中稀释备用. 实验分为3组，每组平行3份试样. 阴性对照组： 0.2 mL稀释兔血加入10 mL生理盐水；阳性对照组：0.2 mL稀释兔血加入10 mL三蒸水；涂层实验组： 0.2 mL稀释兔血加入10 mL浸提液. 37℃水浴60 min，离心，取上清. 在MPSUV260型紫外分光光度仪上测A540 nm值. 溶血率计算公式为：溶血率（%）=（实验组A540 nm-阴性对照组A540 nm）/（阳性对照组A540 nm-阴性对照A540 nm）×100%. 溶血率大于5%则预示阳性结果.
　　1.2.3急性全身毒性试验将PPy涂层用锋利刀片从Ti表面刮下，研磨粉碎后高温高压消毒，无菌条件下配制成100 g/L生理盐水混悬液，使用前37℃下保持1 h. 选用昆明小鼠随机分配为Ti表面PPy涂层实验组和阴性对照组，每组各8只. 实验组采用胃内针给药，1 g/kg. 对照组给以等量的生理盐水. 连续给药7 d，停药后继续观察7 d. 每日检查动物的临床中毒体征，并予以记录. 停药7 d后，采用颈椎脱臼法将动物处死. 取动物心、肝和肾，多聚甲醛固定，常规HE染色后BX41型光学显微镜下观察.
　　1.2.4口腔黏膜刺激试验将金黄色地鼠腹腔注射10 g/L的戊巴比妥钠麻醉动物，消毒，铺巾. 用医用缝合线将试样穿颊黏膜缝合固定到颊囊黏膜上，每只固定经消毒备用的2个试样，左侧为实验组Ti表面PPy涂层试件，右侧为作为阴性对照的Ti试件. 术后每日观察黏膜组织反应及试样在位情况，即试片周围有无充血、糜烂、肿胀等. 术后14 d处死动物，取与材料接触的颊囊部全层组织，HE染色，BX41型光学显微镜进行观察.
　　1.2.5细胞毒性试验按照CB/T16886.52003 《医疗器械生物学评价》体外细胞学毒性试验的试验方法进行［5］. 选择L929细胞为受试细胞株，实验前用PBS新鲜配制MTT溶液，微孔滤器过滤除菌，4℃保存. 取对数生长期的细胞系，常规胰酶消化后制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106 L，接种细胞于96孔培养板（100 μL/孔，n=5），置于5 mL/L CO2， 37℃培养箱中，在饱和湿度条件下培养48 h. 然后将浸提液加入各实验组（150 μL/孔）. 阴性对照为DMEM培养基，阳性对照为1 mL/L苯酚，常规培养. 培养12， 24， 48 h后酶联免疫检测仪测定A570 nm值，并计算出各组的A570 nm均值及细胞增殖百分率（P%）. P%=各浓度组A570 nm均值/阴性对照组A570 nm均值×100%. 按照CB/T16886.52003标准，P%可分为6级： &>100%为0级；75%～100%为Ⅰ级；50%～74%为Ⅱ级；30%～49%为Ⅲ级；15%～29%为Ⅳ级；0～14%为Ⅴ级. 只有细胞毒性为I级或0级的生物材料才能用于体内实验.
　　2结果
　　2.1Ti表面PPy涂层扫描电镜观察高倍镜下可见PPy涂层呈现典型的菜花样、结节样颗粒. 颗粒大小为0.5～1.5 μm左右，颗粒间的孔径大多约在1～2 μm之间（图1）.
　　图1Ti表面聚吡咯涂层形貌SEM ×2000
　　2.2溶血试验各测试组光吸收度测定值见表1，以每组测定值的平均数计算溶血程度，溶血程度为1.49%，小于5%，即Ti表面PPy涂层无溶血反应.
　　2.3短期全身毒性试验所有小鼠在胃内灌入混悬液后2 wk内一般情况良好，活动、进食情况正常，体质量无下降，无步态不稳、惊厥、瘫痪、呼吸困难等不良反应，无死亡. 各组小鼠心、肾、肝的组织切片均未见细胞变性、坏死等病理变化，实验组与对照组无差异.表1各实验组光吸收度测定值 2.4口腔黏膜刺激试验各组金黄色地鼠进食、饮水正常，毛发光泽，反应灵活. 肉眼观察，材料接触处口腔黏膜表面未见明显充血、肿胀、糜烂或溃疡. 组织切片观察，Ti阴性对照组，颊黏膜的黏膜上皮排列整齐，细胞形态正常，较少量炎性细胞浸润，黏膜下结缔组织中有少量血管扩张和充血. Ti表面PPy涂层实验组颊黏膜各层细胞排列整齐，较少量炎性细胞浸润，黏膜下结缔组织中有少量血管扩张和充血（图2）. 实验组与阴性对照组的组织学观察结果相似，均未见明显异常反应.图2Ti表面聚吡咯涂层植入颊黏膜后组织反应×100
　　2.5细胞毒性实验结果各组A570 nm值，细胞增殖率及细胞毒性分级见表2. 倒置相差显微镜观察阳性对照组，正常细胞形态消失，核固缩或溶解，而实验组细胞形态良好，细胞折光性强，与阴性对照组相似，并可见多个分裂相细胞，表明细胞生长旺盛. 细胞毒性测试为0级，说明Ti表面PPy涂层对L929细胞无抑制作用.表2各实验组细胞增殖率及细胞毒性分级
　　3讨论
　　纯钛种植体在体内，直接也是最先与组织、细胞相接触的是材料的表面. 材料的表面性质影响细胞的吸附、增殖、分化等一系列反应. 学者们一直致力于将一些有生理功能的物质如蛋白质、多肽、酶和细胞生长因子等固定在纯钛种植体表面，充当邻近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体. 这种在种植材料表面引入具有诱导骨组织再生的活性因子、细胞或活体组织的方法称为生物材料表面有机修饰. 它能够极大地改善材料的生物学性能，是实现材料良好生物诱导活性的根本途径［5-6］. 然而，金属材料表面与高分子材料完全不同的性质决定了其几乎不存在任何反应性功能基因来连接侧链、配基或生物活性分子，这是钛基金属表面生物有机修饰的技术难点.
　　长期以来，高分子一直被视为结构材料和绝缘材料. 1971年日本化学家白川英树在用齐格勒―纳塔催化剂合成聚乙炔时发现，当聚乙炔与I2，AsF5等反应之后，电导率达到1×102～1×103 S/cm. 传统意义上的绝缘体竟然表现出半导体和导体的许多光、电、磁特性，这对经典的材料分类法和导电理论是巨大的挑战和突破，也意味着新的一代功能高分子的诞生. 鉴于这类聚合物表现出的传统高分子材料所不具备的导体、半导体、铁磁体、发光体等的特性，这类功能高分子被称为导电聚合物（conducting polymers）或合成金属（synthetic metals）. PPy就是其中发现较早并经过系统研究的导电聚合物之一［7］. 因此，我们试图通过PPy的导体特性同钛金属基底形成良好的结合，同时又利用高分子材料表面反应性功能基因丰富的特性来进行生物材料表面有机修饰，从而增强钛种植体的生物活性.
　　对生物材料安全性的评价方法较多，国际标准化组织公布的医疗器械生物学评价试验指南(ISO标准，1997)中基本评价的生物学试验包括细胞毒性、致敏、刺激或皮内反应、全身急性毒性、亚慢性亚急性毒性、遗传毒性、植入、血液相容性等［8-9］. 我们选择了溶血实验、短期全身毒性实验、口腔黏膜刺激实验和细胞毒性试验4种较为常见的生物学试验方法. 其中细胞毒性检测采用MTT试验法，原理为MTT可被线粒体上的脱氢酶还原成蓝紫色结晶，经有机溶剂二甲基亚砜等溶解后可使用分光光度计测定MTT结晶物的染色浓度，从而评价细胞的增殖率和死亡率，操作简便、快速，能够灵敏反映细胞受损害的程度. 我们的结果表明纯钛表面聚吡咯涂层材料不引起溶血反应，不干扰细胞功能，对口腔黏膜显示无刺激性，无短期毒性作用，具有可靠的生物安全性，是一种具有良好生物相容性的材料，具有进一步应用于钛种植体材料表面改性研究的广阔前景.
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