作者：吴成利 师建国 颜真 韩苇 石继红 张英起
【关键词】 基因表达
关键词: 配体;克隆，分子;基因表达;蛋白纯化
摘 要:目的 克隆人FLT3配体（Flt3Ligand，FL）基因，并在大肠杆菌中对FL进行表达、纯化. 方法 分离人外周血单个核细胞，提取总RNA，采用RT-巢式PCR扩增人FLT3配体胞外段基因，以双脱氧终止法进行DNA序列分析;将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-B;重组质粒pRSET-B-FL转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导后，收集细菌，菌体裂解后，利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进行纯化，并进行SDS-PAGE及Western-blot检测. 结果 从人外周血单个核细胞中克隆得到长462bp的FL基因，测序正确;经EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定证实，FL成功地克隆到表达载体pRSET-B;构建的表达载体pRSET-B-FL在大肠杆菌中表达出Mr24000的融合蛋白，经常压离子交换色谱化后的融合蛋白的纯度达到90%，该融合蛋白具有FL抗原特性. 结论 成功地克隆并表达了FL基因，并对融合蛋白进行了初步纯化，为大规模获得FL创造了条件.
Keywords:ligands;cloning，molecular;gene expression;protein purification
Abstract:AIM To clone human FLT3ligand gene，express FL protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS A cDNA encoding soluble FL was cloned through RT-nest-ed PCR from the total RNA extracted from human peripheral blood mononuclear cells and identified by analyzing the nu-cleotide sequences.The human FL gene was subcloned into the expressing vector pRSET-B.The recombinant plasmid pRSET-B-FL was transformed to BL21（DE3），and then FLT3ligand was expressed under the inducement of IPTG.The fused protein was purified by ion exchange methods of SP-Sepharose Fast Flow and Q-Sepharose Fast Flow.SDS-PAGE and Western-blot were employed to identify the ex-pression of human FLT3ligand.RESULTS FL gene with a length of462bp was isolated from human peripheral blood mononuclear cells.Sequence analysis revealed the sequence of FL gene was consistent with relevant reports.FL gene was cloned into the expressing vector pRSET-B identified by enzyme digestion of EcoRⅠand HindⅢenzyme.SDS-PAGE showed that a Mr24000fused protein was expressed in E.coli.The purity of the fused protein obtained by ion exchange method was90%.Wenstern-blot showed the fused protein could be recognized by the anti-FL antibody.CONCLUSION The FL gene was obtained by RT-PCR amplification.The expressing vector of FL was successfully constructed and ex-pressed in E.coli.The fused protein was purified preliminari-ly.The study will provide necessary conditions for obtaining rhFL protein on a large scale.
0 引言
Flt3配体（Flt3Ligand，FL）是一种早期造血生长因子.FL单独作用，对刺激造血的效果不明显，但它与IL-6（白细胞介素6），G-CSF（粒细胞集落刺激因子），GM-CSF（粒-巨噬细胞集落刺激因子）和SCF（干细胞因子）等细胞因子协同作用时，具有刺激造血干/祖细胞增殖的活性［1-4］ .目前研究发现，FL刺激机体产生大量树突状细胞［5-7］ ，从而诱导体内特异的抗肿瘤免疫，可抑制肿瘤的生长［8，9］ .并且，FL在辐射防护方面也有一定作用［10］ .由此可见，FL在干细胞体外扩增移植、外周血干细胞动员、临床肿瘤免疫治疗和辐射防护等方面具有诱人的应用前景.所以，获得人FLT3配体胞外段cDNA以便进行原核表达得到FL蛋白质极为重要.我们以人外周血单个核细胞为来源，克隆得到FL基因，并实现其原核高效表达，摸索了FL蛋白初步纯化的条件，为其大规模制备及其应用奠定了基础.
1 材料和方法
1.1 材料 健康人外周血（西京医院血库）.TaqDNA聚合酶、EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ内切酶、T4DNA连接酶、逆转录酶、RnaseH，oligo（dT）12-18 ，DNA marker、蛋白marker，NucleoTrap Gel Extraction试剂盒、测序试剂盒均为Takara公司产品.SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF购自Pharmacia公司.DTT为Serva公司产品.pGEM-3ZF（-）克隆质粒和表达质粒pRSET-B均为本教研室保存，其余试剂为国产分析纯.
1.2 方法
1.2.1 反转录cDNA第1链 取健康人外周血，分离单个核细胞［5］ .提取总RNA.总RNA5μg加oli-go（dT）
12-18 0.5μg，以DEPC处理水补足体积至25μL，于70℃水浴放置10min，然后迅速转移至50℃;向上述样品中加入25μL42℃预热的反应混合物（DEPC处理水7.5μL，10×PCR缓冲液5μL，25mmol・L-1 MgCl2 5μL.10mmol・L-1 4×dNTPs2.5μL，0.1mol・L-1 DTT5μL）和3.3μkat逆转录酶，50℃水浴孵育50min;70℃水浴15min终止反应后，将样品置于冰上冷却，然后加入RNaseH并移至37℃水浴孵育20min.
1.2.2 巢式PCR扩增FLcDNA 外侧引物1，5’端引物:5’--3’cg gaa ttc gag act tgt tct tct gtc cc;3’端引物:5’--3’cg gga tcc tca gtg ctc cac aag cag c;内侧引物2，5’端引物:5’--3’cg gga tcc aac ggc acc cag gac tgc tcc ttc;3’端引物:5’--3’cgt aag ctt cta tgt cgg ggc tgt ggc ctc.取1μL FLcDNA为模板，加入10×PCR缓冲液5μL，25mmol・L-1 MgCl2 5μL.25mmol・L-1 4×dNTPs1μL，25μmol・L-1 外侧引物各1μL，用水补足体积至50μL，上覆石蜡油.95℃预变性5min后，加TaqDNA聚合酶，94℃60s，55℃60s，72℃60s.扩增30个循环.取第1轮PCR扩增产物1μL为模板，加入内侧引物进行第2轮PCR扩增（其他成分同上）.94℃60s，55℃60s，72℃60s.扩增30个循环.
1.2.3 重组pGEM-3zf（-）-FL的构建 取纯化后经 EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切的FL基因片段60ng，纯化后经EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切的pGEM-3zf（-）质粒20ng，T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶10×缓冲液1μL，用水补足体积至10μL，16℃连接12h，以5μL连接产物转化100μL大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取转化皿上生长的单菌落，扩大培养后提取质粒，用EcoRⅠ，BamHⅠ限制酶进行酶切鉴定.
1.2.4 DNA序列分析 取重组质粒3～5μg为模板，经PE公司的310自动测序仪测序.
1.2.5 重组表达载体的构建 从重组的pGEM-3zf（-）-FL质粒上用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切下目的片段.再用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切下pRSET-B载体.载体和目的片段均用NucleoTrap Gel Extrac-tion试剂盒从琼脂糖凝胶内回收.然后进行DNA连接，将DNA连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用氨苄青霉素（Amp）抗性进行筛选，经酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆.
1.2.6 蛋白的诱导表达与Western-blot鉴定 挑取pRSET-B-FL重组表达菌株，接种于5mL含Amp的LB培养基，37℃培养过夜，次日按5%转接于含Amp的LB培养基，37℃振荡培养3h，加入IPTG（异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度1mmol・L-1 诱导表达，37℃振荡培养4h，取菌体，做120g・L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）.Western-blot鉴定参照文献［11］.
1.2.7 FL融合蛋白的纯化 将诱导表达的大肠杆菌离心收集菌体，加入裂解液（20mmol・L-1 Tris-HCl，pH8.0，2.5mmol・L-1 EDTA，10mmol・L-1 MgCl2 ，1mg・L-1 DNase），高压匀浆裂菌后，12000g・min-1 离心收集上清，将250g・L-1 硫酸铵在2min内缓慢加入不停搅动的裂菌上清，4℃放置1h后，12000g・min-1 离心收集上清，用pH8.0，20mmol・L-1 Tris-HCl缓冲液4℃透析24h，中间换1次透析液，12000g・min-1 离心收集上清，将上清上到用缓冲液A（pH8.0，20mmol・L-1 Tris-HCl）平衡过的Q-Sepharose FF阴离子柱，上样后用缓冲液B（pH8.0，20mmol・L-1 Tris-HCl，1mol・L-1 NaCl）线形梯度洗脱，将穿过峰和洗脱峰收集后，经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在第2个洗脱峰.将收集到的第2个洗脱峰的样品用pH6.0，20mmol・L-1 PBS缓冲液4℃透析24h，中间换1次透析液，12000g・min-1 离心收集上清，将上清上到用缓冲液A（pH8.0，20mmol・L-1 Tris-HCl）平衡过的SP-Sepharose FF阳离子柱，上样后用缓冲液B线形梯度洗脱（pH6.0，20mmol・L-1 PBS，1mol・L-1 NaCl），将穿过峰和洗脱峰收集后，SDS-PAGE分析鉴定.
2 结果
2.1 RT┐巢式PCR RT-巢式PCR扩增后琼脂糖电泳的结果显示产物为462bp的一条带，大小与预计相符（Fig1）.
图1 略
2.2 重组质粒pGEM┐3zf（┐）┐FL的构建及鉴定 PCR获得的FL基因片段经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，与经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的pGEM-3zf（-）质粒连接，得到的重组质粒用EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切，得到462bp的目的基因片段（Fig2），证明获得了pGEM-3zf（-）-FL重组体.
图2 略
2.3 DNA序列分析 以T7，SP6Promotor引物从pGEM-3zf（-）-FL模板的正反两方向进行测序，结果表明克隆的基因序列与文献［12］报道的人FLcDNA序列一致（Fig3）.
2.4 重组质粒pRSET┐B┐FL的构建及鉴定 将经EcoRⅠ和HindⅢ酶切pGEM-3zf（-）-FL所得的FL基因片段与经EcoRⅠ和HindⅢ酶切处理的pRSET-B表达载体相连接，获得含有FL的pRSET-B表达载体的阳性克隆（Fig4）.
图4 略
2.5 重组表达载体pRSET┐B┐FL的诱导表达及Western┐blot鉴定 将经EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定过的重组质粒pRSET-B-FL转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达后，取样处理，进行120g・L-1 SDS-PAGE，约在Mr 24000处有一明显的新生带，与FL融合蛋白预计的相对分子量相符，其表达量约占细菌蛋白质总量20%，主要以可溶形式存在.以羊抗人的FL mAb进行免疫印迹反应，约在Mr 24000有明显的唯一反应带（Fig5），表明该融合蛋白具有FL的抗原性.
图5 略
2.6 FL融合蛋白的纯化 收集诱导菌液的菌体，经裂菌后，SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在上清中.将FL融合蛋白的裂菌上清经250g・L-1 硫酸铵沉淀后，经SDS-PAGE分析，目的蛋白在上清中，将其用pH8.0，20mmol・L-1 Tris-HCl缓冲液透析24h后上Q-Sepharose FF阴离子柱，收集各个洗脱峰后，经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在第2个洗脱峰，并且除去了一部分杂蛋白.将收集到的第2个洗脱峰的样品用pH6.0，20mmol・L-1 PBS透析24h后上SP-Sepharose FF阳离子柱，收集各个洗脱峰后，经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白在第1个洗脱峰，蛋白纯度达到90%（Fig6）.
图6 略
3 讨论
克隆FL基因多采用骨髓、胎盘等造血组织［13］ ，人外周血单个核细胞中FL也有较高表达［14］ ，并且来源广泛、操作简单，因此我们从人外周血单个核细胞中克隆FL胞外段基因.正常生理条件下，FL蛋白有膜结合型和可溶型两种形式，前者是由N端信号肽、胞外区、跨膜区和胞质区组成的Ⅰ型跨膜蛋白，表达在细胞表面，可能通过作用于临近细胞上的特异性受体发挥作用;后者实际上是膜结合型蛋白的胞外区，它以可溶形式存在，保留了与特异受体识别和结合的能力，可以作用于远程细胞或组织上的受体.蛋白酶对膜结合蛋白的切割或mRNA的不同拼接是可溶型FL生成的机制［15］ .设计引物扩增FL胞外区cDNA，为其在原核中表达及功能研究提供了条件.由于FL mRNA在正常细胞和组织中的含量很低，为提高PCR反应的效率及特异性，设计了内外两对引物，采用巢式PCR的方法扩增目的基因.外引物扩增FL跨膜蛋白的整个编码序列，长981bp;内侧引物扩增编码第27-182个氨基酸的FL胞外区.实验中，我们发现，目的基因3’端的长短对其表达有影响，开始我们表达156个氨基酸的FL蛋白，试过各种载体，均无表达，文献［15］报道表达有153个氨基酸的FL蛋白，于是我们重新设计了3’端引物，减少了两个氨基酸，结果用表达载体pRSET-B表达了FL.pRSET-B是一个受PT7 强启动子驱动下的融合表达载体，因而易于在原核进行目的基因高表达.另外，在目的基因的5’端融合了6个组氨酸的纯化标签，可以用金属螯合亲和层析来分离纯化表达的融合蛋白.但是由于金属螯合亲和层析的方法不经济，无法用于大规模的生产，因此我们根据将来生产的要求，采用离子交换层析法对融合蛋白经行纯化.我们发现融合蛋白主要以可溶的形式存在，经过一系列不同浓度硫酸铵沉淀，融合蛋白在250g・L-1 硫酸铵沉淀时，沉淀中没有融合蛋白，同时又近可能的将其他杂蛋白沉淀出.经过两次离子交换层析，获得了纯度达90%的融合蛋白.
本研究成功地克隆到人FLcDNA，构建了FL的原核表达载体并在大肠杆菌中得到高效表达，对FL融合蛋白进行了初步纯化，为下一步细胞、动物实验以及大规模生产奠定了基础.
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