作者：柏长青 戚好文 王玉 王德堂 郭慧玲
【关键词】 克拉霉素
关键词: 克拉霉素;血管生成;Lewis肺癌
摘 要:目的 研究克拉霉素对血管生成的影响并在此基础上观察其抗肿瘤转移的作用，为其临床应用提供实验依据. 方法 采用b-FGF诱导小鼠腹壁Matrigel种植体方法进行血管生成实验，比较克拉霉素处理组和对照组Matrigel种植体内血红蛋白含量和微血管面积的差异.采用Lewis肺癌C57BL/6小鼠模型，观察比较克拉霉素对肿瘤组织内微血管密度、移植瘤体积、肺脏转移和实验小鼠存活时间的影响. 结果 克拉霉素剂量大于或等于40mg・kg-1 ・d-1 时，Matrigel种植体中血红蛋白含量和微血管面积开始明显减少，并具有剂量-效应关系.克拉霉素能够明显降低肿瘤组织内的微血管密度［（27±10）vs（14±7），P=0.042］，肺脏转移瘤数量［（10±5）vs（17±9），P=0.039］并明显延长荷瘤小鼠的存活时间［（27±10）d vs（19±8）d，P=0.022］. 结论 克拉霉素对b-FGF诱导和肿瘤组织内的血管生成均具有明显抑制作用，能够有效减少荷瘤小鼠的肿瘤转移并延长存活时间，在肿瘤的综合治疗中具有一定的应用价值.
Keywords:clarithromycin;angiogenesis;carcinoma，lewis lung
Abrtract:AIM To study the inhibitory effect of clar-ithromycin on angiogenesis and tumor metastasis in mice.METHODS Using quantitative analysis to compare hemoglobin and microvascular areas in Matrigel implant be-tween the study group and the control group.The quantita-tion of microvessel density in tumor，occurrence of lung metastasis，tumor volume and mean survival time were ana-lyzed in Lewis tumor-bearing C57BL/6mice.RESULTS Quantitative analysis of hemoglobin and microvascular areas in Matrigel implant indicated that clarithromycin can inhibit angiogenesis at high concentration.Clarithromycin effectively reduced the quantitation of microvessel density in tumor，the number of tumor nodule in the lung and increased the mean survival time of tumor-bearing mice.CONCLUSION Clar-ithromycin has inhibitory effect on angiogenesis and tumor metastasis and might have therapeutic value in tumor treat-ment.
0 引言
血管生成（angiogenesis）在肿瘤的生长和转移中发挥着重要的作用，抗血管生成是目前肿瘤治疗的热点课题［1，2］ .克拉霉素（clarithromycin，CAM）是临床上常用的新型14环大环内酯类抗生素，近年来有关此类抗生素具有生物反应调节作用的研究引人注目［3-5］ ，由于CAM参与调控的细胞因子中许多与血管生成密切相关，因此CAM可能具有潜在的抗血管生成作用.鉴于此，我们采用Matrigel种植体的方法，观察CAM对b-FGF诱导小鼠腹壁血管生成的影响，并在此基础上观察其对Lewis肺癌血管生成和肺脏转移的抑制作用.
1 材料和方法
1.1 材料 6～8wk龄C57BL/6小鼠（购自第四军医大学实验动物中心），雌雄不拘，体质量（20±3）g.Lewis肺癌瘤株（上海市医药工业研究院药理研究室馈赠），CAM（Abbott Co.Ltd产品，西安利君制药集团馈赠，用50g・L-1 葡萄糖稀释至实验浓度），Ma-trigel（BD Labware），b-FGF（BD Labware），肝素（Gibco），Triton-100（Sigma），血红蛋白测定试剂（Sigma），CD31抗体（Santa Cruz），S-P组化试剂盒（北京中山生物公司）.
1.2 方法
1.2.1 Matrigel种植与分组［6］ 用含牛血清白蛋白的PBS液分别稀释b-FGF、肝素至实验浓度，取b-FGF50μL（100ng）、肝素50μL（50U）与冰浴中的Matrigel500μL混匀，小鼠麻醉后腹部正中区域皮下注射.CAM抑制实验于Matrigel种植前3d开始，按10～70mg・kg-1 ・d-1 的剂量梯度分为7个剂量组，每组5只，经胃管给实验小鼠灌注，1次・d-1 ，连续8d，对照小鼠以等体积50g・L-1 葡萄糖代替CAM，灌注方法和时间同实验组.
1.2.2 血红蛋白含量测定 Matrigel种植5d后断颈处死小鼠，手术切开腹部皮肤，取出Matrigel种植体，生理盐水中清洗2～3次.将Matrigel种植体置于干冰上干燥12h称重，悬浮于0.5mL0.01g・L-1 Triton-100中1～2h并用吸管吹成悬液，15000g离心15min，用分光光度计测量上清中的血红蛋白A405nm 值.
1.2.3 微血管面积的测定 Matrigel种植体经常规固定，石蜡包埋，制成5μm切片，常规脱蜡，逐渐水化，先经30mL・L-1 h3 O2 阻断内源性过氧化物酶，0.01mol・L-1 枸缘酸缓冲液行抗原修复，再依次加入30mL・L-1 小牛血清、CD31抗体、生物素化羊抗兔抗体和SP复合物.以上各步骤之间均经37℃恒温箱孵育30min，PBS冲洗（小牛血清除外），最后用DAB染色，苏木素复染，树脂封片，用PBS代替CD31抗体为空白对照.采用盲法进行结果判断:每只实验动物随机选5张切片进行分析，先在低倍光镜（×100）下检查整个切片，找到并选取微血管最多的3个视野（热点），数码相机高倍镜下（×200）摄片，Leica MD20型图像分析仪测定血管面积.
1.2.4 肿瘤模型复制及分组 无菌条件下从供瘤鼠上摘除生长良好的肿瘤，生理盐水洗净血污，眼科剪将肿瘤块剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，每克肿瘤组织加3.0mL生理盐水，玻璃匀浆器匀浆，200目尼龙网滤过后取0.2mL肿瘤匀浆接种于C57BL/6小鼠右肋处皮下，复制肿瘤模型.小鼠接种肿瘤匀浆6h后，随机分成实验组和对照组，每组15只.实验组:按50mg・kg-1 ・d-1 的剂量，腹腔内注射CAM，1次・d-1 ，连用21d.对照组:用等体积的50g・L-1 葡萄糖代替CAM，注射方法和时间与实验组相同.
1.2.5 疗效判定 ①存活时间:每日观察并记录荷瘤小鼠的存活状况，直至死亡;②移植瘤体积:肿瘤接种7d后，每3d用游标卡尺测量移植瘤大小，按公式:V=（长×宽2 ）×0.52计算肿瘤体积（mm3 ）;③移植瘤内的微血管密度（micro-vascular density，MVD）:参考刘飞等［7］ 方法略加改进，肿瘤接种后第16日，每组随机挑选荷瘤小鼠5只，断颈处死，取出移植肿瘤，按照上述微血管面积的测量方法进行血管染色并计数MVD，每一个清晰的阳性染色视为一个血管，取其平均值作为每只小鼠每个高倍视野内的MVD;④肺脏转移:小鼠死亡后，立即取出肺脏，40g・L-1 多聚甲醛固定，解剖显微镜下计数肺脏表面的肿瘤结节.
统计学处理:实验结果用x ±s表示，采用方差分析和t检验进行分析比较，所有统计计算均在SPSS10.0软件上进行，检验水准为双侧P&<0.05.
2 结果
2.1 CAM对Matrigel种植体内血红蛋白含量的影响 当CAM剂量大于40mg・kg-1 ・d-1 时，Matrigel种植体中血红蛋白含量开始明显减少，与对照组相比有显著性差异（P&<0.05），减少程度与CAM浓度之间呈现明显的剂量-效应关系（r=-0.843，P&<0.01，Tab1）.
表1 Matrigel种植体中血红蛋白含量 略
2.2 CAM对Matrigel种植体内微血管面积的影响 同种植体内血红蛋白含量变化一样，当CAM剂量到达40mg・kg-1 ・d-1 时，Matrigel种植体内的微血管面积开始明显减少，随着CAM剂量的增加，减少程度逐渐加重（r=-0.641，P&<0.01），最高可减少微血管面积的50%（Fig1，Tab2）.
2.3 CAM对肿瘤组织内MVD的影响 本实验中阳性染色为棕黄色，对照小鼠中微血管走向清晰，数目较多，而实验组中的微血管数目明显减少，结构也较为模糊.经统计对照组和实验组MVD分别为27±10和14±7，两者差异非常显著（P=0.042，95%CI0.64～25.98，Fig2）.
表2 Matrigel种植体内的微血管面积 略
2.4 CAM对移植瘤体积的影响 肿瘤接种9～12d后，可长至1.5cm×1.0cm×1.0cm大小，随着时间的延长，移植瘤体积继续增大，部分小鼠移植瘤的中心区域出现溃烂.尽管实验小鼠肿瘤体积的测量值在各时间点均小于对照小鼠，但统计学分析两者无显著性差异（P=0.067）.
2.5 CAM对移植瘤肺脏转移的影响 CAM治疗组小鼠肺脏表面的肿瘤结节数为10±5，较对照组17±9减少42.7%，两组相比差异非常显著（P=0.039，95%CI0.42～14.20）.
2.6 CAM对荷瘤小鼠存活时间的影响 实验组小鼠和对照组小鼠的平均存活时间分别为（27±10）d和（19±8）d，实验小鼠的平均存活时间是对照小鼠的1.4倍，两者相比差异非常显著（P=0.022，95%CI1.25～14.6）.
图1 略
3 讨论
近30年的研究表明:肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成是使肿瘤能够获得足够的营养物质，促成上述转变的关键环节.如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过2mm×2mm×2mm.与肿瘤生长依赖与血管生成一样，肿瘤的转移也是血管依赖的，原发肿瘤在血管生成之前很少进入血液循环，但在血管生成之后则能连续不断的进入血液循环，究其原因是因为肿瘤新生血管高度扭曲，分布紊乱，管腔不规则扩张，特别是其管壁较薄，内皮细胞间存在较大的间隙并缺乏完整的基底膜，因此具有较大的渗漏性.此外由肿瘤细胞释放的b-FGF，VEGF等血管生成因子，使得正处于增殖期的内皮细胞产生更多的纤溶酶原激活剂和胶原酶，又进一步加剧了基底膜的分解，促进肿瘤细胞进入血液循环.由此可见，血管生成是肿瘤转移所必需的结构基础.血管生成是一个极其复杂的过程，涉及到血管生成因子与抑制因子之间的调节失衡.目前已分离和纯化了20多种血管生成因子，近10种血管生成抑制因子，在所有的血管生成因子中，对VEGF及b-FGF的研究最为深入，它们与肿瘤血管生成的关系也最为肯定［1，2］ .Matrigel是从EHS小鼠肿瘤中提取的一种混合蛋白，其内含有层连蛋白、I型胶原、类肝素、蛋白多糖、生长因子、基质金属蛋白酶等多种与血管生成有关的物质，是血管生成实验的常用材料，在国外的同类研究中广为应用［8，9］ .
在临床常用药物中筛寻血管生成抑制剂是国内外研究者经常采用的研究方法之一［15］ ，由于这些药物作用机制、使用剂量和毒副反应较为明确，因而是一种低投入、短周期的研究策略.对CAM的抗肿瘤作用及其机制，特别是CAM与化疗、放疗、手术相结合治疗肿瘤安全性和有效性的进一步探讨，有可能发现一种使用方便的抗肿瘤血管生成制剂，为肿瘤的综 合治疗增添新的有效手段.
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