作者：刘同刚 唐敏章 金发光 张生勇 匡永清
【关键词】 阿霉素
关键词: 阿霉素;脂质体;L-α-二软脂酰磷脂酰胆碱
摘 要:目的 探讨以L-α-二软脂酰磷脂酰胆碱（DPPC）和盐酸阿霉素（ADM）为原料制备的温度敏感阿霉素脂质体（Ts-LADM）的温度控释特性和稳定性. 方法 采用改良逆相蒸发法，以DPPC和ADM为原料制备Ts-LADM，动力学光散射法测定其粒径，以荧光分光光度法检测样本中阿霉素含量，计算包裹率.纯化后的Ts-LADM在不同温度下水浴后经葡聚糖凝胶分离并回收脂质体部分，以酸性乙醇法测定阿霉素的释放量，计算释放率. 结果 Ts-LADM粒径分布范围为0.1～0.43μm，平均粒径0.28μm;平均包裹率为37.3%;在不同温度下测定的药物释放率分别为:40℃以下小于20%，在DPPC的相变温度附近突然升高，41℃和42℃分别为81.4%和81.6%，44℃时降为77.2%.42℃下延长加热时间药物释放率无明显增加（P&>0.05）.未经纯化的脂质体于常温下避光贮存5wk，测定其药物包裹率及渗漏率无明显改变（P&>0.05）. 结论 温度敏感阿霉素脂质体具有良好的温度控释特性和稳定性.
Keywords:adriamycin;liposome;DPPC
Abstract:AIM To explore the thermo-controlled release characteristics and stability of thermo-sensitive liposome of adriamycin（Ts-LADM）prepared with L-α-dipalmitoyl-phos-phatidylcholine（DPPC）and adriamycin（ADM）.METHODS Ts-LADM was made by improved reverse phase evapora-tion（REPE）with DPPC and ADM.The vesicle diameter was determined by dynamic light scattering（DLS）.Encapsu-lation rate was calculated after measurement of ADM in sam-ples through fluorospectrophotometry.The liposome was re-trieved from purified Ts-LADM through sephadex，and the release of ADM was determined by means of acidity ethanol technique.RESULTS The vesicle diameter ranged from0.1μm to0.43μm，with an average of0.28μm，and the average encapsulating rate was37.3%.Measured at different tem-peratures，the ratio of drug release reached the peak around the phase transition temperature of DPPC，which was81.4%at41℃and81.6%at42℃，whereas it was less than20%under40℃and77.2%above44℃respectively，but no fur-ther increase was observed when the temperature was main-tained at42℃（P&>0.05）.The encapsulation and leakage of unpurified Ts-LADM remained stable（P&>0.05）when it was stored for5weeks at room temperature and free from light.CONCLUSION Ts-LADM was proved to have good thermo-controlled characteristics and stability.
0 引言
脂质体的磷脂膜在其相变温度时，可由凝胶态转为液晶态，在磷脂双分子层结构发生改变的过程中，膜的通透性会增加，其内容物漏出增加，作为药物载体而具有温度控制释放的特性.我们以相变温度［1］ 为42℃的L-α-二软脂酰磷脂酰胆碱（DPPC）为膜材制成的阿霉素脂质体显示出良好的温度控制释放的特性和稳定性.
1 材料和方法
1.1 材料 盐酸阿霉素:浙江海门制药厂产品;L-α-二软脂酰磷脂酰胆碱（DPPC）:Sigma公司产品.Ts-LADM的制备采用逆相蒸发法（REV），并对脂质浓度及制备程序作一些改进，制备成Ts-LADM.将DPPC溶于新蒸氯仿-甲醇（V∶V=2∶1）混合液中，配制成一定浓度，将其置入100mL圆底烧瓶中进行旋转减压蒸发，制成脂质薄膜;加入一定量的以灭菌蒸馏水配制的盐酸阿霉素水溶液（20g・L-1 ），充入氮气密封，在45～50℃水浴下旋转分散.分散了的溶液以探头式超声处理器（100mA）进行超声处理，每处理5min间隔以氮气吹冷冷却1～2min，再于无菌条件下以0.22μm滤膜加压过滤两次，即制成Ts-LADM原液，置于无菌瓶中充氮气密封，4℃避光保存.取以相同方法及处理条件制成的4批Ts-LADM原液各0.5mL混合，加蒸馏水稀释到20mL，加入Malvern5000型激光粒径分析仪（英国Malvern）样品池，以动力学光散射法（DLS）［2］ 测定Ts-LADM的粒径为0.1～0.43（平均0.28）μm.
1.2 方法 阿霉素含量测定采用酸性乙醇荧光分光光度法［3，4］ .以吸收光波长500nm，发射光波长550nm，在RF-450型荧光分光光度计（日本岛津）上测定阿霉素标准液的荧光值E，并求出标准方程:Con=10.8376E-117.1179μg・L-1 （其中Con为样品阿霉素浓度，线性范围5～1000μg・L-1 ）相关系数r=0.9999（n=3）.Ts-LADM包裹率的测定:将一定量的Ts-LADM原液加入1cm×30cm的葡聚糖凝胶Sephadex-G25（Pharmacia公司产品）柱.以Hepes缓冲液洗脱，分离并收集Ts-LADM悬液及游离药物分离液.取游离药物分离液50μL经酸性乙醇稀释后测定其荧光值.再取Ts-LADM原液10μL以酸性乙醇稀释后测定其荧光值.以标准方程计算出Ts-LADM原液的总药物浓度CT 和游离药物浓度CF ，根据下式计算包裹率（%）=（1-CF /CT ）×100%.Ts-LADM的稳定性:将Ts-LADM原液0.6mL密封置于常温下避光存放，每wk分别取0.1mL经Sephadex-G25凝胶柱（1cm×10cm）过滤，按上述方法测定包裹率，并取分离后的Ts-LADM悬液50μL经酸性乙醇稀释后测定荧光值，计算包裹药物浓度，并根据下式计算其渗漏率（%）=（1-Ct /C0 ）×100%.C0 为开始的包裹药物浓度;Ct 为第t周的包裹药物浓度.Ts-LADM的温度控释特性:取6组试管（每组3支）分别置于30，38，40，41，42和44℃水浴中预热15min后，在试管中加入200μL新制纯化的Ts-LADM悬液（浓度为C），振摇10min后迅速将试管置于10℃水中振摇冷却，加入葡聚糖凝胶柱Sephadex-G25（1cm×10cm），以Hepes缓冲液洗脱，分离漏出的游离阿霉素，收集脂质体部分;取其中200μL加入酸性乙醇混合稀释，测定其荧光值，计算其包裹阿霉素的浓度Ca，以下式计算药物释放率（%）=（1-Ca /C）×100%.再取2组试管42℃水浴预热后加入200μL Ts-LADM悬液分别振摇30和60min后取出迅速冷却，以相同方法分离并测定其荧光值，计算药物释放率.
2 结果
2.1 Ts┐LADM包裹率和稳定性 以改良逆相蒸发法制备的4批Ts-LADM平均包裹率为37.3%，Ts-LADM原液常温存放5wk，无絮状物、沉淀或分层现象.检测其包裹率和渗漏率（Tab1）存放前后平均包裹率无改变（P&>0.05），同时几乎无药物渗漏，说明以Ts-LADM原液的形式在室温下贮存是十分稳定的.
表1 Ts-LADM原液常温贮存5wk包裹率和渗漏率的变化 略
2.2 Ts┐LADM的温度控释特性 Ts-LADM在其相变温度附近时，被包封的阿霉素的释放量突然增至最大，为总包封量的81.6%，说明Ts-LADM具有敏感的温度控释特性（Fig1）.同时，为确认在某一温度下药物释放量与加温时间的关系，测定在42℃下水浴30和60min的Ts-LADM悬液的阿霉素释放量分别为81.4%（s:1.8%）和82.1%（s:2.2%），与相同温度下加热10min的释放率81.6%（s:1.7%）比较无差异（F=0.11，P=0.9004）.说明在60min内Ts-LADM的药物释放量基本上不随加温时间的延长而增加.
3 讨论
脂质体载药系统具有众多优点［5，6］ .脂质体是由磷脂双分子层构成，在某些因素如高温、离子等作用下可发生融合、破裂、沉淀，破坏脂质体结构，使其稳定性降低.DPPC为二元饱和磷脂，具有较高的稳定性;同时因DPPC不带电荷［7，8］ ，有利于在相变温度时最大限度地释放出阿霉素.实验证明，以Ts-LADM原液贮存观察5wk，无沉淀、聚积，几乎无渗漏，说明Ts-LADM原液具有良好的稳定性.
图1 略
在释放实验中，加热温度为41～42℃时药物释放量达到最高，为包裹量的81.6%，与其相变温度一致;延长加热时间释放量无明显改变，但仍有约18%的药物未释放.可能的原因是当膜通透性增加时，由于缓冲液的pH（7.4）高于脂质体内阿霉素水溶液的pH（3～6），使脂质体内pH升高，阿霉素去质子化嵌入膜疏水层中而不被释放.由于脂质体在由凝胶态转变为液晶结构的相变温度时，其磷脂的脂酰链紊乱度及活动度增加，膜通透性增大，故此时所包封药物的释放速度最大;偏离相变温度时的释放都应是缓慢的.但实际测定不可能将处于室温的脂质体跨跃41℃的条件下获得释放结果，故提供的41℃以上的释放百分率高于理论值.以本实验条件控制制备的大单层温度敏感脂质体，呈现了良好的温度控释性和
稳定性，为进一步进行体内实验提供了前提.
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