作者：吴中亮 刘飞 游思维 焦西英 鞠躬
【关键词】 脑缺血
关键词: 安定;凋亡;坏死;脑缺血;脑梗塞
摘 要:目的 研究安定对光化学诱发脑梗死后细胞死亡的保护作用. 方法 使用光化学诱发的大鼠局灶性脑缺血模型.采用原位末端标记技术（TUNEL）检测凋亡细胞.大鼠脑梗死术后存活3，6，12，24，48和72h，分别观察梗死灶坏死中心面积和凋亡细胞数目.术前24h开始腹腔注射安定（10mg・kg-1 ・8h-1 ），直到处死动物. 结果 TUNEL阳性细胞位于坏死中心与正常皮层之间的半影区.TUNEL阳性细胞的均数随着梗死后时间的延长逐渐增多，24h达到高峰.在24h时间点，安定治疗组梗死坏死中心的平均最大面积和TUNEL阳性细胞均数与对照组相比，明显减少（P&<0.001）. 结论 安定可明显减少成年大鼠局灶性脑梗死后的细胞坏死和凋亡.该结果可为临床使用安定治疗缺血性脑血管病提供理论依据.
Keywords:diazepam;apoptosis;necrosis;cerebral ischemia;cerebral infarction
Abstract:AIM To study the protective effects of diazepam against nervous cell death after photochemically induced cere-bral ischemia.METHODS Focal cerebral ischemia induced by photothrombosis in adult rats was used as a model.Apop-tosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling（TUNEL）.The areas of necrotic cores and the numbers of apoptotic cells were studied quantitatively in the infarcted area at3，6，12，24，48and72h after operation，respectively.Repeated in-traperitoneal injections of diazepam（10mg・kg-1 ・8h-1 ）were given，starting at24h prior to the operation and contin-uing till the animals were sacrificed.RESULTS The TUNEL-positive cells were located in the transitional zone between the necrotic core and normal cortex.The mean num-ber of TUENL-positive cells was increased sharply when the postoperative time increased from3，6to12h and peaked at24h.The mean maximum area of the necrotic cores and mean number of TUNEL-positive cells at24h were signifi-cantly decreased（P&<0.001）in the diazepam-treated experi-mental group than in the saline-treated control group.CONCLUSION Diazepam can significantly reduce both necrosis and apoptosis following cerebral ischemia induced by photothrombosis in adult rats.These findings provide a theo-retical warranty for the clinical use of diazepam in ischemic cerebrovascular diseases.
0 引言
近年来有研究显示，安定具有保护脑部缺血性神经元，防止其退行性变的作用［1，2］ .我们采用大鼠光化学局灶性脑梗死模型，观察安定对大鼠脑梗死后半影区神经细胞凋亡的影响，旨在探索治疗脑梗死的新途径与方法.
1 材料和方法
1.1 材料 SD雄性大鼠48只，体质量200～250g，由第四军医大学实验动物中心提供.其中36只大鼠按术后存活3，6，12，24，48和72h随机分为6组，每个时间点6只;另外12只大鼠被随机分为安定治疗组和对照组，每组6只.
1.2 方法
1.2.1 大鼠光化学脑梗死模型 动物均采用10g・L-1 戊巴比妥钠50mg・kg-1 ，腹腔注射麻醉，俯卧位固定于脑立体定向仪上（Narishiga，日本）.常规皮肤消毒，正中矢状切开头皮，细心分离部分颞肌以暴露顶叶，光导纤维（孔径3mm）置于前囟后3mm、矢状缝左旁开3mm之交点处，光纤与颅骨表面距离为2mm.其下对应于顶叶感觉皮层（parietal sensory cortex）.光照前1min内自尾静脉注射玫瑰红B（10g・L-1 ，生理盐水配制），剂量25mg・kg-1 .光照强度1W・cm2 ，照射时间10min，造成局部皮层缺血梗死［3］ .照射过程中颅骨表面温度为（36±1）℃，照射完毕缝合头皮.安定治疗组大鼠术前24h开始腹腔注射安定注射液，剂量10mg・kg-1 ・8h-1 ，直至处死动物;对照组将安定换成等量的生理盐水，其余同安定组.
1.2.2 组织处理 术后大鼠存活24h，再次麻醉，经升主动脉用生理盐水冲洗，40g・L-1 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（4℃，pH7.4）灌注固定后取脑，观察梗死灶，而后以200g・L-1 蔗糖-PB于4℃浸泡直至沉底.经恒冷箱行冠状连续切片，片厚10μm，取每5张中的第一张，贴于多聚赖氨酸处理的切片上，尼氏染色显示梗死面积.
1.2.3 TUNEL染色和计数 每只大鼠取其最大梗死截面的3张相邻切片，行TUNEL染色.使用Roche公司提供的In situ cell death detection kit，操作步骤按说明书进行.切片经40g・L-1 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（4℃，pH7.4）固定20min，置1g・L-1 柠檬酸钠（内含10mL・L-1 Triton X-100）中冰浴2min，然后加50μL TUNEL反应液，在避光、保湿条件下37℃孵育60min.共聚焦荧光显微镜下观察结果.阴性对照省去末端脱氧转移酶或标记的核苷，其余同TUNEL染色.计数3张切片梗死区所有TUENL阳性细胞的总数，得出每组的均数，用one-way analysis of variance（ANOVA）分析结果.另取安定治疗组每只大鼠经尼氏染色显示最大梗死坏死截面的3张相邻切片，用图像分析系统（Leica Q570c）得出每只大鼠梗死坏死中心的平均最大面积.比较安定治疗组和对照组间平均最大梗死中心面积和平均TUENL阳性细胞数，结果用student t检验进行统计分析.
2 结果
2.1 尼氏染色 梗死区与周围正常脑组织间有一明显的分界线，易于区分.半影区位于梗塞中心区和正常脑组织之间，梗死中心内几乎未见神经组织细胞.
2.2 TUNEL阳性细胞的时空分布 TUNEL阳性 细胞仅分布于半影区，梗死区以外未见TUNEL阳性细胞.TUNEL阳性细胞的均数，随着梗死后时间的延长明显逐渐增多（Fig1），在3，6和12h时间点分别为（422±81，636±80，882±193），24h达到高峰（1320±217）.然后开始下降，在48h为353±97，到72h仍有少量阳性细胞（164±39）.
2.3 安定对梗死区细胞死亡的作用 TUNEL阳性细胞仅分布于半影区，梗死区以外未见TUNEL阳性细胞（Fig2）.安定治疗组梗死坏死中心的平均最大面积（1.92±0.51）mm2 ;TUNEL阳性细胞均数为（512±106）;与对照组相比［分别为（3.88±0.63）mm2 和1240±232］，明显减少（P&<0.001，Fig3～5）.
3 讨论
脑梗死的病理改变由梗死中心区和处于低灌流状态的边缘区即缺血性半影区（ischemic penumbra）组成.中心区的脑组织在短时间内即发生不可逆性损伤，导致细胞坏死;而半影区的脑细胞由于仍保留了正常供氧的20%～50%［4］ ，损伤相对较轻，可继续维持数小时，如能及时恢复血流或采用药物治疗，则可能被挽救，否则转变为不可逆性损伤，使梗死灶扩大.因此，治疗脑梗死的重点在于挽救缺血性半影区内的神经元，减少死亡（包括坏死和凋亡）;抑制凋亡过程［3，5］ .半影区细胞主要的死亡方式是凋亡［5，6］ ，这是由于这些细胞仍保持了部分蛋白合成能力并表达某些凋亡相关基因［7-9］ .
图2 － 图5 略
脑缺血导致细胞死亡有坏死和凋亡两种机制.TUNEL并非是凋亡的特异性标志，因为坏死细胞也可出现DNA片断化，坏死细胞也可为TUNEL阳性细胞［10］ .在不同的哺乳动物中，使用包括大脑中动脉闭塞及光化学等不同的方法诱发出的局灶或全脑梗死，其细胞坏死主要集中在缺血中心;而凋亡细胞主要发生于半影区［4，5］ .在本实验中，TUNEL阳性细胞仅出现于半影区，坏死中心区未见TUNEL阳性细胞，说明本实验中的TUNEL阳性细胞主要是凋亡细胞.有文献［5］ 报道用光化学诱发大鼠顶叶皮质梗死，其梗死区TUNEL阳性细胞的峰值出现在12～24h或24h［8］ .我们的实验结果显示，脑梗死后凋亡细胞的数量随时间延长而增多，24h达高峰.本结果为通过药物抑制凋亡形成从而治疗卒中提供了一个时间窗.Schwartz等［10，11］ 报道安定对沙土鼠短暂性全脑缺血性损伤有较强的保护作用，可预防大剂量甲基苯丙胺对大鼠脑内5-羟色胺和多巴胺能神经元的神经毒作用.Dowden等［2］ 通过组织学方法观察到，安定对沙土鼠脑缺血后海马CA1神经元具有明显保护作用.在本研究中，大鼠脑梗死前24h开始给予安定，持续到术后24h动物处死为止;实验结果显示，安定可明显地减少坏死中心的面积和大鼠脑梗死后半影区神经细胞的凋亡，提示安定对脑梗死后的细胞凋亡和坏死均有保护作用.
安定保护脑梗死后神经细胞的机制目前尚不清楚.Schwartz等［10］ 认为，脑缺血后兴奋性氨基酸过多地集聚在突触间隙，激活兴奋性氨基酸受体，进而引起缺血神经元钙离子异常内流.钙离子内流在缺血导致的神经元死亡过程中起着重要作用.增强脑缺血后抑制性的神经传递（如γ-氨酪酸，GABA）可抵制缺血引起的兴奋，达到保护神经元的目的.安定是GABA的增强剂，可增加GABA引起的氯离子通道的开放，保护缺血神经元.Hu等［1］ 等观察到安定能通过调节兴奋性氨基酸和自由基的合成与释放保护 缺血神经元.
本研究结果提示，在缺血性脑损伤发生24h内进行安定干预，可明显减少大鼠脑梗死后半影区神经细胞的凋亡，减少坏死中心面积.为临床上治疗缺血性脑血管病的时机和方法提供了理论依据.
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