作者：王新园 范清宇 张殿忠 蒋维中 文艳华
【关键词】 60，Co照射
关键词:60 Co照射;离体神经;原位再植;骨骼肌;运动终板;乙酰胆碱酯酶
摘 要:目的 探讨变性神经移植后骨骼肌神经末稍和运动终板的再生情况. 方法 将60 Co先期辐射处理后的兔自体神经原位再植.术后4，6和8mo取术侧腓肠肌，乙酰胆碱脂酶（AchE）组化法显示神经终末及运动终板.光镜检查并用图像分析仪测间接反映终板成熟程度的灰度值. 结果 实验组术后4mo时的AchE阳性反应呈棕红色或棕褐色，分布稀疏离散、不规则.AchE结合镀银切片上，AchE阳性部位示较明显的棕黑色沉淀，存在单根神经末稍支配单个运动终板，但数目极少.术后6，8mo的AchE阳性反应是棕红色或棕灰色沉淀，分布较规则.结合镀银的切片上神经末稍与运动终板相连较多，单根神经末稍支配一个运动终板后，偶有再次分支支配另一个运动终板.术后8mo，AchE与正常对照未见统计学差异（P&>0.05）而术后4和6mo，与正常肌组织中的AchE比较，仍有显著性差异（P&<0.01）. 结论 长段自体神经（约3cm）经60 Co先期处理后再植，去神经支配骨骼肌可恢复再支配.
Keywords:cobalt-60beam irradiation;exsomatized nerve;interpositional replantation;skeletal muscle;mo-tor endplate;acetylcholinesterase（AchE）
Abstract:AIM To evaluate regeneration changes of nerve-endings and motor endplates of skeletal muscles after nerve degeneration transplantation.METHODS Nerve segment of30mm in length in sciatic nerve excised from the adult health rabbit（Chinese big-ear rabbit）and irradiated with350Gy60 Co beam before being replanted interpositionally.The spec-iments of the gastrocnemius muscles were cut from the oper-ated limb of the animal at4，6and8months after grafting re-spectively and stained with the method of AchE histochem-istry for revealing nerve-endings and motor endplates.RE┐SULTS Brown-red or brown-grey AchE-positive precipi-tates were seen at4months with irregular profile and regular profile at6and8months.AchE-conbined with silver stain section showed claw-like regeneration nerve fibers connected with the AchE-positive area at8months.Meanwhile，one nerve-ending innervating one motor endplate can be seen and nerveending innervating one motor endplate with sub-nerve ending innervating another motor endplate can be seen occa-sionally，too.CONCLUSION Reinner-vation can be ob-tained following pretreated by60 Co beam irradiation.
0 引言
四肢巨大肿瘤保肢术后造成的获得性关键神经的牺牲，往往涉及功能重建和神经移植.尤其对长段主要神经干的缺损，仍是临床上处理较棘手的问题［1］ .因此，周围神经再生便成为临床上亟待解决的重要课题;同时也是神经生物学领域中研究的热点［1-3，5-7］ .因此研究变性神经移植后运动终板与神经末稍的变化很有必要.
1 材料和方法
1.1 材料 采用健康中国家兔30只，雌雄不限，体质量2.0～2.2kg，随机分为2组.实验组18只，对照组12只.实验动物用戊巴比妥钠（30mg・kg-1 ）腹腔麻醉下取右大腿后部正中切口，显露梨状肌下缘至胫腓分叉处的坐骨神经段，切取30mm长坐骨神经，无菌状态下经350Gy60 Co辐照9min30s以成无活性组织.用9～0无创缝线镜下原位断端外膜缝合.对照组切取后不经60 Co照射直接原位外膜缝合.术后单笼饲养，定期观察、取材.所有离体神经切断、再植历时约2h后原位缝合.照射距离为35cm，剂量率为3411.68伦琴，剂量吸收率为350Gy.
1.2 方法 ①检测时间:分别于术后4，6和8mo取材做组织学检查.②组织学检查为运动终板及神经末稍组化染色:术后4，6和8mo左右手术侧腓肠肌中部取材，硫化胆碱-亚铁氰化铜反应显示胆碱酯酶.观察肌组织中AchE阳性反应沉淀.Gros-Bielshowsky法显示神经末稍.
图像分析:乙酰胆碱酯酶应用计算机图像处理系统测定灰定值，结果统计分析.组织化学法应严格控制条件:采用同一试剂，确定测试系统的统一灰度基准和同一光度强度.
2 结果
2.1 实验组 术后4mo的腓肠肌切片上，AchE阳性反应呈棕红色或棕褐色，分布稀疏离散，不规则（Fig1）MEP形态不规则，有的凝聚，有的崩解扩散呈“亚铃”状，亦有呈棒状或不规则状.着色较浅，银复染已不能显示神经末稍.术后6mo，腓肠肌切片AchE染色渐加深，AchE重新聚积，形态尚规则（Fig2）AchE结合镀银的切片上，AchE阳性部位显示为较为明显的棕黑色沉淀，呈圆形或椭圆形，存在单根神经末稍支配单个MEP（Fig3）.术后8mo AchE染色呈棕褐色或棕黑色，大多数呈圆形或椭圆形，较规则地排列在腓肠肌的中上边缘部，形态与色泽接近正常，且较丰富（Fig4）.银复染后可见肌纤维间隙中有丰富的再生神经纤维末稍，呈“爪”状分布，神经纤维沿肌纤维表面行走一段距离后进入终板（Fig5）.偶有神经末稍再次分支支配另一个MEP.
图1 －图5 略
2.2 对照组 对照组4，6和8mo的结果同实验组6，8mo情形相似.
2.3 计算机图像分析处理 术后4，6和8mo，实验组术侧腓肠肌胆碱脂酶组化染色图像分析灰度值结果:4，6mo时与正常对照组存在显著性差异（P&<0.01），而8mo时与正常对照组无统计学差异（P&>0.05，Tab1）.
3 讨论
再生运动神经的功能恢复最后要靠运动终板（motor endplate，MEP）的再生与重建，终板的功能状态能反映出肌肉的功能.Ranish认为周围神经离断后2wk内，远端及去神经支配骨骼肌的AchE活性明显减低.AchE阳性反应的出现，可认为是神经纤维再生标志之一［3］ .我们的实验在严格控制组化染色条件，如室温、试剂浓度、孵育时间等，动态观察术后4，6和8mo AchE染色深浅.术后4mo AchE着色淡，6，8mo以后色泽加深，并接近正常.统计结果提示各时间段存在显著性差异.我们的研究表明:①随着再生神经的不断生长，AchE活性不断增强;②
60 Co照射组，新鲜离断植入组去神经支配骨骼肌重新得到再生神经纤维支配.张毅等［4］ 认为，在严格控制组化染色条件下，微机图像分析测试系统可以准确，迅速地对关节软骨不同层次的修复中的变化规律.他们对组化染色切片进行灰度值测定.结果判定:淡染→灰度值↑→含量低;浓度→灰度值↓→含量高.我们采用图像分析技术对术侧腓肠肌切片AchE进行定量灰度值分析，目的是确定或检测神经修复不同时间段，再生轴突到达终末器官的数目，以及成熟的程度，用灰度值来间接反映再生神经纤维的情况.
金冶华等［5］ 证实小剂量X线照射有效地抑制少突胶质生成和形成髓鞘，从而促进了神经元轴突的再生长.王新园等［6］ 报导经辐照等先期处理后，当Schwann细胞受损并降解而被吞噬细胞所吞噬或排除，残剩其基膜被保留在原位，这种基膜在神经移植 中可能做为一种“引物”或“有效导管”而助周围神经的再生.因此，尽管采用了致死剂量的60 Co照射，神经纤维生长仍然通过移植段进入了远端，使神经功能得以恢复.我们的实验结果证实了这一点.
一些学者认为失神经支配的终板可释放一些神经趋向因子吸引再生的神经纤维向终板区生长.本实验通过神经后装置（subneural apparatus）的组化染色，提示再生的轴突总是在终板附近分枝“芽生”（sprouting），重新支配运动终板，也可分支再次支配另外的终板.一般认为这些神经趋向因子不是残存在终板上的乙酰胆碱酯酶.
我们的实验主要通过观察移植神经段经60 Co辐射灭活后原位再植的骨骼肌运动终板的再形成，来证实神经纤维再生情况这一事实，有关其他问题，将另文报道.至于再生神经纤维如何支配相应骨骼肌以及运动终板如何形成等，尚需更进一步的认识和深入的研究.
参考文献
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