关于纯化的结核菌素衍生蛋白免疫刺激后小鼠脑内的Fos表达

作者：王凌　汉江　邝芳　王百忍　鞠躬

【关键词】 结核菌素衍生蛋白
　　关键词: 结核菌素衍生蛋白;Fos;免疫应答
　　摘 要:目的 进一步阐明中枢神经系统参与免疫调节的部位. 方法 用免疫组织化学方法观察纯化的结核菌素衍生蛋白（PPD）免疫刺激后不同时间点小鼠脑内的Fos蛋白表达. 结果 PPD初次免疫后3，9，14，18和21d时再追加免疫后7，14d的动物，孤束核、延髓腹外侧区、中央灰质、海马、新皮质等多数脑区在各个时间点均可见到较强的Fos表达.但不同时间点的Fos表达不完全相同，尤为明显的是，追加免疫后扣带回出现明显的Fos表达，且左侧较右侧强. 结论 免疫应答过程中有多个脑区参与对免疫信息的感知和调控，皮质在对免疫反应的调节中有侧别差异.
　　
　　Keywords:tuberculin purified protein derivative;Fos;im-mune response
　　
　　Abstract:AIM To further identify the response of brain ar-eas to the immune stimulus.METHODS Using immunohis-tochemistry method，we observed the Fos expression in the brain of purified protein derivative of tuberculin（PPD）im-munized mice at different time points.RESULTS At3，9，14，18，21d following the primary immunization and7，14d following the second immunization，strong Fos immunostain-ing was observed in many brain areas such as the ventrolater-al medulla，central gray，hippocampus and neocortex.But the patterns at different time were not completely the same，especially in the cingulate cortex.Fos expression in the right side is stronger than that in the left side after second immu-nization with PPD.CONCLUSION It is suggested that many brain areas participate in the interaction of immune and central nervous system，and that brain asymmetry might be associated with the peripheral immune response.
　　
　　0 引言
　　
　　大量证据表明中枢神经系统可接受免疫刺激信息并参与对免疫反应的调节，但中枢神经系统参与免疫调节的神经核团及环路目前尚不明确.现在研究中枢神经系统调控免疫应答的方法主要包括损毁特定脑区后观察对免疫反应的影响、记录免疫应答时脑内神经元的电活动以及观察细胞因子或内毒素对中枢神经系统的作用等［1］ ，这些研究方法由于各自的局限性不能完整地反映中枢参与免疫调节的部位.c-fos原癌基因及其编码的相关蛋白（Fos，FosB，Fra1，Fra2等）作为神经元激活的标志，近年来在神经系统形态和功能相结合的研究中得到了广泛应用［2］ .借助此技术有人［3］ 发现icv或ip细胞因子可诱发大鼠脑内特定核团表达c-fos mRNA，但单纯用细胞因子并不能完整系统地反映免疫应答过程中中枢神经系统的反应.我们用一种胸腺依赖抗原纯化的结核菌素衍生蛋白（purified protein derived from tu-berculin，PPD）免疫小鼠，建立免疫应答模型，观察免疫后不同时间点小鼠脑内的Fos表达，为阐明中枢神经系统参与免疫调节的部位提供线索.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 BALB/c雄性小鼠6～8wk28只，由本校实验动物中心提供，随机分为7组，分为初次免疫后3，9，14，18和21d组及追加免疫后7，14d组，每组4只，其中3只为实验组接受免疫刺激，1只为对照.实验前2wk从该中心领回在实验室安静环境中饲养，4只・笼-1 ，每天保持12h明/暗交替环境.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 PPD免疫模型的建立 初次免疫时将PPD溶于灭菌生理盐水，再与等量的弗氏完全佐剂混合，磨成乳化剂，实验组每只小鼠ip500μL，含PPD30μg.于初次免疫后21d再进行追加免疫，每只小鼠ip上述PPD液500μL，含PPD30μg.对照动物ip等量的灭菌生理盐水.
　　
　　1.2.2 动物固定及组织处理 各组动物免疫后成活不同时间，在乙醚深麻下，经心脏取血0.5mL（用于检测血中抗PPD特异性抗体的滴度），然后经左心室先灌流生理盐水10mL，再灌注用0.1mol・L-1 PB（pH7.4）配制的40g・L-1 多聚甲醛50mL，立即取脑，置同样固定液中后固定3h，转入200g・L-1 蔗糖中4℃过夜.全脑行冠状切面的冰冻切片，片厚40μm，隔6张取1张.按ABC法行Fos蛋白染色.兔抗Fos抗体（1∶3000，Santa Cruz Tech.Inc.），4℃，48h;生物素化的羊抗兔IgG（1∶500，Sigma），室温3h;ABC复合物，室温3h;葡萄糖-DAB-硫酸镍胺法呈色;然后脱水，透明，封片.
　　
　　图1 －图3 略
　　
　　2 结果
　　
　　实验组PPD免疫刺激后动物脑内有多个脑区可见到大量的Fos阳性神经元.初次免疫后3d，延髓腹外侧区、孤束核、蓝斑、臂旁外侧核、中央灰质腹外侧部、束旁核、前顶盖前核背侧部、后连合核、弓状核、未定带、中央杏仁核、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、下丘脑外侧核（Fig1）、视上核、视交叉上核、视前区、外侧隔核、终纹床核、海马、齿状回（Fig2）有较强的Fos表达，新皮质、梨状皮质、扣带回和嗅脑也可见大量深染的Fos免疫阳性产物，双侧无明显区别.9d时大部分脑区如海马、新皮质、扣带回和下丘脑室旁核的Fos表达减弱.初次免疫后14d，除新皮质、扣带回、下丘脑室旁核的Fos表达仍然较弱外，大部分脑区的Fos表达再次增强，中缝核群也出现明显的Fos标记.18d时，下丘脑室旁核的染色明显增强，新皮质、扣带回的Fos阳性神经元仍然较少.21d时，脑内的Fos表达与18d组类似，但下丘脑室旁核的Fos表达减弱.追加免疫后第7日（即初次免疫后28d），外侧隔核、终纹床核、中央杏仁核、下丘脑室旁核、海马、齿状回、新皮质的Fos表达明显增强，扣带回的Fos表达也增多，而且出现侧别差异，左侧较右侧明显为多（Fig3）.追加免疫后14d（即初次免疫后35d），脑内Fos表达与追加7d组类似，扣带回Fos表达仍为左侧强于右侧，同时丘脑腹后核也出现较弱的标记. 对照组各个时间点组动物脑内仅有少量的Fos阳性产物偶见于额叶皮质、丘脑室旁核、弓状核等，且染色浅淡. 转贴于 　　实验组动物血中抗PPD抗体的检测用间接ELISA方法，结果显示初次免疫后血中抗体于9d达到高峰，18d降至最低点，继而再次上升，追加免疫后的抗体生成高峰期为追加免疫后7d（Fig4）.
　　
　　图4 略
　　
　　3 讨论
　　
　　我们首次用抗原免疫作为免疫激发模型，用Fos表达作为神经元激活的标志，动态观察了针对特异性抗原的长时程免疫应答中中枢神经系统的活动.我们观察到胸腺依赖性抗原PPD初次和再次免疫后，动物脑内表达Fos蛋白的脑区甚为广泛，在各个时间点被抗原免疫所激活的脑区基本一致，但在少数核团的表达强度上又有所差异，这可能提示不同的脑区与免疫应答的不同环节的调控有关.以血中特异性抗体生成水平为免疫反应的指标，初次免疫后3d为第1次抗体生成高峰前期，此时动物脑内多个脑区已出现明显的Fos表达.以往的研究也证实其中的某些脑区与免疫反应有关.Day等［3］ 报道白细胞介素1β中枢或外周作用后孤束核、下丘脑室旁核、中央杏仁核、终纹床核内c-fos mRNA表达增加.早期的损毁实验发现，损毁背侧海马和杏仁复合体导致一过性的脾，胸腺细胞数量增加和T细胞增殖反应增强［4］ ;外侧隔核损毁后可导致一种T细胞应答的明显改变［5］ ;损毁前下丘脑主要产生对免疫系统的抑制作用［4］ ;损毁延髓尾侧网状结构、中缝核、臂旁核等脑干结构都不同程度地影响免疫功能［6］ .但我们的实验中还观察到一些以往没有报道的在免疫激发时被激活的核团，如束旁核、前顶盖前核、后连合核等，这些 核团是否与免疫调节直接有关尚待进一步研究.
　　
　　Renoux等［7］ 关于大脑皮层的免疫调节作用的研究指出，这一作用有侧别的差异，大范围损毁左侧半球导致对免疫功能的抑制，而损毁右侧半球则有相反作用;他还发现损毁左半球可抑制IgG类抗体的产生，而对IgM类抗体合成无影响［8］ .扣带回参与调节细胞免疫反应在损毁实验中已得到证实［9］ ，但在我们的实验中观察到追加免疫后扣带回的Fos表达左侧明显强于右侧，而初次免疫后双侧扣带回的反应无明显差异，提示左右侧扣带回对免疫反应的调控在免疫应答的不同阶段有所不同，左右侧扣带回在对抗体生成以及对不同类型的免疫应答的调控中是否也有存在差异是值得深入探讨的问题.
　　
　　我们还发现，在第1次抗体生成高峰期即初次免疫后9d，下丘脑室旁核的Fos表达明显减弱;而在血中抗体水平下降期即初次免疫后18d，下丘脑室旁核的Fos表达增强，提示下丘脑室旁核与初次免疫应答时外周血中特异性抗体的生成有关.在追加免疫后的抗体生成高峰期，与初次免疫后的抗体生成高峰期相比，下丘脑室旁核有大量的Fos表达，这可能反映两次免疫应答所产生的淋巴因子不同，与此相一致，Saphier等［10］ 用绵羊红细胞免疫动物后发现，下丘脑室旁核在免疫后的前3d神经元放电频率降低，于6d，即初次免疫应答抗体产生高峰期（5d）后，神经元放电频率增加.追加免疫时，神经元的放电频率变化不如初次应答明显.下丘脑室旁核是神经免疫内分泌网络中的重要一环，它可能通过激活HPA轴和交感神经系统抑制免疫系统的过度活动.
　　
　　上述研究表明，神经系统对抗原免疫刺激的反应是涉及多脑区的复杂的反应，中枢神经系统有多个核团参与构成调节免疫反应的神经环路，在免疫应答的不同阶段和不同的免疫应答中，中枢神经系统的反应可能也有所不同.
　　参考文献:
　　
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