作者：李立宏 高国栋 王学廉 张宝国
【关键词】 超微结构
关键词: 超微结构;PC12细胞;凋亡;帕金森病;多巴胺
摘 要:目的 研究帕金森病（PD）多巴胺能神经元的死亡机制. 方法 在免疫组织化学基础上，采用流式细胞仪、电泳及电镜技术观察不同浓度多巴胺（DA）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的超微结构及生化改变. 结果 适当浓度DA可诱导PC12细胞凋亡.早期表现为线粒体结构及功能的改变并有抗凋亡蛋白bcl-2的表达，后期电镜下可见凋亡特征性核结构改变及典型的DNA“阶梯状”电泳带. 结论 细胞凋亡参与了PD的病变过程，线粒体在早期细胞凋亡中起着重要的调节作用.
Keywords: ultrastructure; PC12 cells; apoptosis;Parkinson’s disease;dopamine
Abstract:AIM To study the mechanism of dopaminergic neuronal death of Parkinson’s diseases（PD）.METHODS Using the flow cytometry，electron microscope，elec-trophoresis and the immunohistochemistry technology，we observed the alteration of ultrastructure and biochemistry of the apoptosis on PC12cells induced by dopamine with differ-ent concentration.RESULTS Moderate concentrations of dopamine（DA）induced apoptosis in PC12cell.The early al-teration was that of structure and function of mitochondrion and the expression of bcl-2anti-apoptosis protein.Then the specific nuclear ultrastructure of apoptosis and the typical DNA“ladder”electrochromatography were found.CON┐CLUSION Apoptosis may be involved in the pathogenesis of PD，and the mitochodria plays a significant role in the early apoptosis of cells.
0 引言
帕金森病的特征性病理改变为黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性死亡、缺失.其具体机制迄今尚不完全明确，目前认为PD患者脑内氧化应激反应过强，导致脑内神经递质多巴胺异常代谢产生过量的反应性氧自由基在其中起重要作用［1］ .细胞凋亡是致病因子或异常信号诱导发生的“生理性”的主动细胞死亡过程.它可能参与了PD的发病过程［2，3］ .PC12细胞株做为一种儿茶酚胺类细胞株，被广泛应用于神经细胞死亡方式及毒性损害研究.我们主要观察多巴胺（DA）诱导PC12细胞凋亡的早期超微结构变化，以探讨细胞凋亡在PD的发病机制中的作用.
1 材料和方法
1.1 细胞培养 PC12细胞株（购于中国科学院上海细胞生物研究所）置于RPMI-1640培养液中，内含200mL・L-1 胎牛血清，谷氨酰胺2mmol・L-1 ，青霉素50ku・L-1 ，链霉素25mg・L-1 ，培养瓶中预先铺以200mg・L
-1 鼠尾胶，用于细胞传代，置于50mL・L-1 CO2 孵箱37℃培养，隔天换液.
1.2 药物处理 待PC12细胞生长良好时加入多巴胺0.5mmol・L-1 ，同时将部分细胞置于培养皿中，进行细胞爬片.空白对照组加入RPMI-1640培养液.分别培养12及24h.
1.3 形态学观察 分别取0.5mmol・L-1 多巴胺培养12h及24h的细胞片，福尔马林固定30min，0.01mmol・L
-1 PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，HE染色光镜下观察.
1.4 流式细胞仪检测 分别取0.5mmol・L-1 DA处理12及24h的细胞液经2.5g・L-1 胰酶和2.0g・L-1 EDTA液消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度1×109 ・L-1 ，离心后弃去上清液，重悬浮于5mL，4℃预冷的葡萄糖盐水中，按每1mL悬液加入2mL4℃冷乙醇的量固定24h，按1∶1加入碘化丙啶（PI）染色，4℃放置25min，流式细胞仪中进行分析.
1.5 免疫组织化学bcl┐2染色 应用SABC 试剂盒，将细胞片置于30mL・L-1 h3 O2 中常温处理10min;蒸镏水洗涤3次;加入血清封闭液20min;加入bcl-2抗体37℃1h;0.01mmol・L-1 PBS洗涤3次;加入生物素化二抗37℃20min;PBS洗涤3次;加入SABC 试剂37℃20min;PBS洗涤4次;DAB显色;苏木素轻度复染，脱水封片镜检.
1.6 电镜检查 分别将0.5mmol・L-1 DA处理12及24h的细胞悬液离心后弃去上清，加入30mL・L-1 戊二醛固定30min，送电镜室做超薄切片，JEM-2000EX型透射电镜下观察照相.
1.7 DNA凝胶电泳 分别取0.5mmol・L-1 DA处理12及24h的细胞液，调整细胞浓度5×109 ・L-1 ，裂解液裂解，RNAase，蛋白酶K孵育，酚抽提，乙醇沉淀，每样品提取DNA10μg经琼脂糖凝胶行电泳分析.
2 结果
2.1 形态学观察 0.5mmol・L-1 多巴胺作用12h细胞HE染色形态学无明显改变，可见核分裂相减少（1个/HP）.24h则呈典型凋亡形态学改变，可见凋亡小体.空白对照组细胞生长旺盛，核分裂相明显（6个/HP）.
2.2 流式细胞仪检测 0.5mmol・L-1 多巴胺作用PC12细胞12h时流式细胞仪检测未见凋亡峰，但同空白对照组比较“S”期细胞明显下降，由38.7%下降为16.1%，表明细胞增殖明显抑制.而0.5mmol・L-1 多巴胺作用PC12细胞24h时流式细胞仪检测可见典型亚二倍体凋亡峰（AP），凋亡率为47.6%（Fig1～4）.
图1 －图4 略
2.3 免疫组化bcl┐2表达 在0.5mmol・L-1 多巴胺作用的PC12细胞中，无论12h还是24h光镜下均可见部分细胞胞质呈棕黄色，有棕黄色颗粒（bcl-2阳性细胞），部分细胞胞质呈淡紫色（阴性细胞）.但12h表达阳性率明显高于24h，呈强阳性，以后逐渐下降.而空白对照组胞质均为淡紫色未见bcl-2表达，细胞生长旺盛（Fig5）.
2.4 电镜检查 0.5mmol・L-1 DA作用PC12细胞12h时电镜下未见明显凋亡特征性核改变，细胞形态稍有变化，可见线粒体肿胀、嵴不明显及内质网扩张.而24h则可见典型核结构改变:即核浓缩及凋亡小体.空白对照组细胞及细胞器形态正常，可见核分裂相（Fig6，7）.
2.5 电泳分析 24h条件可见典型“阶梯样”DNA降解片段，而空白对照组及12h组无此变化（Fig8）.
3 讨论
目前PD的临床药物治疗主要是左旋多巴（L-dopa）类药物替代疗法，通过补充外源性DA来弥补脑内多巴胺的不足，缓解临床症状.但近年来研究认为DA可能对PD患者残存的多巴胺能神经元具有损伤作用，从而加速PD的发展过程［1］ .细胞凋亡是致病因子或异常信号诱导发生的“生理性”的主动细胞死亡过程.这是一种受基因调控的特殊类型的细胞死亡.近年来研究发现PD患者多巴胺能神经元在形态学上呈凋亡样改变，提示细胞凋亡可能参与了PD的发病过程［2］ .PC12细胞做为一种儿茶酚胺类细胞，其胞质中含有大量嗜铬颗粒，富含合成及分解多巴胺所必需的酶类（如TH，DG，MAO及COMT等），在有神经生长因子存在的培养条件下可分化为交感神经元样细胞，使其在形态、生理及生化功能等方面更接近神经元.被广泛应用于神经元死亡方式及毒性损害的研究，特别是PD的研究，为国内外研究PD的常见的细胞模型［4］ .
许多实验表明多巴胺可诱导PC12细胞凋亡，且在一定范围内这种凋亡呈剂量及时间依赖性，以0.5mmol・L
-1 多巴胺诱导的凋亡率为最高［3］ .其12h流式细胞仪虽未见明显凋亡峰，但可见细胞生长“S”期明显呈抑制状态，此时bcl-2染色呈强阳性，表明细胞正在动用自身调节机制对抗凋亡.24h则可见明显凋亡峰，凋亡率为47.6%，此时bcl-2染色强度较12h明显下降，表明细胞凋亡已不可逆转.
bcl-2蛋白作为BCL-2家族中起抗凋亡作用的一种蛋白，主要定位于线粒体外膜，本实验中在电镜及电泳尚未出现凋亡典型的核结构改变时，在凋亡早期12h内即有bcl-2的表达，这表明早期的凋亡同线粒体有重要联系.近年来线粒体在凋亡中的重要作用日益引起人们的广泛关注.Guideok等研究发现多种因素诱导细胞出现凋亡特征性细胞核改变之前，均可观察到线粒体跨膜电位（Δφm）的下降，提示Δφm下降是凋亡的早期特征.其主要功能是维持细胞正常的通透性.bcl-2做为一种抗凋亡作用的蛋白质，主要是通过稳定Δφm、阻止线粒体细胞色素C的释放、抑制Ca2+ 的外流及自由基的形成等机制来维持线粒体结构及功能稳定性，从而发挥其抗凋亡作用的［5］ .进一步研究发现当线粒体细胞色素C释放后，bcl-2则不能阻止细胞凋亡的发生，表明bcl-2对凋亡的调控部位在线粒体，而后者的结构和功能的改变是凋亡细胞超微结构的早期变化.最近研究发现PD患者黑质纹状体细胞线粒体内复合物I缺陷［6］ ，从而导致其通透性增加对自由基损伤更加敏感，ATP合成障碍，引起DA能神经元死亡，这与本实验研究有相同之处.
在本实验中，当DA作用时间进一步延长（&>12h），导致线粒体细胞色素C释放、bcl-2表达量下降、能量代谢障碍功能丧失时，表明凋亡已不可逆转.此时电镜下可见典型凋亡细胞超微结构改变:染色体浓缩并聚积在核膜周围形成新月样结构、核浓缩，随之出现核碎裂及凋亡小体形成等［7］ .DNA电泳则可见典型“阶梯状”DNA降解片段.这种“阶梯状”DNA电泳主要是由于凋亡细胞自身的核酸内切酶被激活，引起自身DNA被降解成180～200bp的寡核苷酸片段而形成的，在流式细胞仪检测时则表现为亚二倍体凋亡峰（AP）.
关于PD患者黑质多巴胺能神经元具体死亡机制迄今尚未完全明了，目前认为与PD患者脑内氧化应激反应增强，加速了DA的氧化，产生过量的反应性自由基密切相关.在脑内DA既可通过自身氧化亦可通过MAO-B酶氧化产生大量超氧自由基、h3 O2 及高毒性的羟自由基等产物，诱导神经元发生死亡［8］ .同时最新研究发现PD患者黑质部位还原型GSH及谷胱甘肽超氧化物酶减少约50%左右，导致该区域神经元保护功能明显减弱［9］ .因此我们认为早期使用MAO-B抑制剂及抗氧化类神经元保护剂有助于PD的治疗，延缓病程发展.
参考文献
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