【关键词】 血管平滑肌细胞
关键词: 血管平滑肌细胞;三维培养;细胞培养/方法
摘 要:目的 观察兔血管平滑肌细胞（VSMCS ）在三维培养系统中的生物学特性. 方法 在兔主动脉中膜来源的VSM-CS 单层培养系统的基础上，将VSMCS 培养在胶原凝胶中，形成VSMCS 三维培养系统.并对细胞的形态结构、生长增殖及其影响因素进行研究. 结果 ①三维培养VSMCS 在凝胶形成后3～4h，形成多个细胞突起，呈星状.后继续伸展，呈梭形、纺锤形.②张力条件下，三维培养VSMCS 可呈一定的方向性排列.③三维培养VSMC
S 与经典的单层培养相比，细胞活力无统计学差异.但细胞增殖受到一定程度的抑制. 结论 运用VSMCS 三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构、生长增殖等方面，还可研究在张力条件下的细胞生物学特征，对组织工程化血管的研究将产生积极的影响.
Keywords:vascular smooth muscle cell;three-dimensional culture;cell culture/methods
Abstract:AIM To study the biologic characteristics of rab-bit vascular smooth muscle cell（VSMCS ）cultured in“three-dimensional”cell culture system.METHODS Based on the monolayer cell culture system，we resuspended VSMCS de-rived from the media of arterial wall in a solution of polymer-izing collagen to develop a“three-dimensional”cell culture system.In this system，we studied the morphology，growth，proliferation and metabolism of VSMCS ，and the shape and arrangement of VSMC influenced by retraction of the sub┐strate.RESULTS ①After VSMCS were cultured in“three-dimensional”cell culture system for3～4hours，they formed many cell prominences.With cells extending，the shape of the cells changed from star to shuttle or spindle.②Under the condition of tension，VSMCS cultured in“three-dimensional”cell culture system took on directionally specific arrange-ment.③In contrast to the monolayer cell culture system，the livingness of VSMCS cultured in“three-dimensional”cell cul-ture system had no statistical difference，but collagen re-strained cell proliferation.CONCLUSION VSMCS “three-di-mensional”culture system will have a positive effect on the study of tissue-engineering vessel.
0 引言
血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCS ）位于动脉壁中膜，它对管壁的完整性和调节血管的紧张性起着重要作用.在经典的单层培养系统中，VSMCS 离开了在体内与细胞外基质共同构成的三维立体生长环境，因而所表现出的生物学特性与在体状态存在较大的差异.我们在VSMCS 单层培养的基础上，将兔主动脉VSMCS 置于胶原凝胶中，使其在体外与细胞外基质形成一个整体，观察其在三维状态下的生物学特征，为构造结构和功能与在体血管中膜相似的中膜组织，最终形成组织工程化血管提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 VSMCS 培养 VSMCS 来自新西兰大耳白雄性家兔，体质量2.0～2.5kg（由本校实验动物中心提供）.30～40mg・kg-1 戊巴比妥钠静脉麻醉后，在无菌条件下，迅速将主动脉自胸腔取出，放入盛有D-Hanks液的平皿中.清洗凝血块，剥除外膜，将血管翻转使内膜面朝外，用刀片自上而下刮1～2遍，去除血管内皮细胞.然后用显微镊撕下血管中膜的平滑肌层，用显微剪将其剪碎（0.5～1mm3 ），接种于培养瓶中，在950mL・L-1 空气，50mL・L-1 二氧化碳，37℃，饱和湿度条件下放置2.5～3h，使组织块较牢固地粘附于瓶壁，加入含200mL・L-1 新生牛血清（Hyclone公司）的DMEM（Dulbecco’s modified minimal essential medium，Gibco公司）培养液，3～4d更换含100mL・L-1 新生牛血清的DMEM培养液1次.细胞生长形成致密单层时，细胞呈典型的峰-谷样表现（Fig1）.此时可用1.25g・L-1 胰蛋白酶（Sigma公司）消化，按1∶2比例分种传代培养，5～6d可继续分种传代1次.VSMCS 行α-激动蛋白抗体（中山公司）SABC法免疫组化染色鉴定（Fig2）.实验采用第2～4代细胞进行研究.
1.2 胶原制备［1］ 实验所用胶原溶液为可溶性鼠尾腱胶原，其主要成分为I型胶原.将体质量200～250g的SD大鼠尾部剪下，浸入70mL・L-1 乙醇溶液中，20min后在无菌条件下抽出尾腱并将其剪碎，置入0.5mL・L-1 的醋酸溶液中（约150mL/尾），在4℃条件下不时搅拌.48h后离心（10000r・min-1 ，11000g，LG10-2.4A，北京医用离心机厂）约1.5h，去渣.上清液用100g・L-1 NaCl溶液盐析，最后将沉淀的蛋白质溶于4℃1mmol・L-1 的HCl溶液中备用.Lowry法测定蛋白浓度为4g・L-1 .
1.3 VSMCS 三维培养系统的建立［2］ 将第2～4代指数生长期VSMCS 用1.25g・L-1 胰蛋白酶消化，调整细胞悬液浓度为5×109 个・L-1 .按细胞悬液2V∶新生牛血清1V∶5×DMEM液2V∶胶原溶液5V的比例，4℃条件下将四种成分快速混匀，加入数滴1mol・L-1 NaOH调pH值至中性（培养液中酚红指示），形成VSMCS -胶原混悬液，并立即将该混悬液移入6孔培养板（Nunc公司）内，0.5mL/孔，置37℃培养箱内10min，混悬液即形成凝胶状，即VSMCS 三维培养系统.每孔加入2mL含100mL・L-1 新生牛血清的DMEM液，3d换液1次.
1.4 观察指标 ①细胞形态学观察:在含VSMCS 凝胶块形成后4，12，24，48，72h和1wk时，在倒置显微镜下观察凝胶块中VSMCS 形态学的改变.将培养24h的凝胶块经30mL・L-1 戊二醛原位固定、脱水、干燥、喷金行S-2700型扫描电镜（HITACHI公司，西安交通大学电镜室）观察.②张力条件下的细胞形态学改变:在上述的VSMC
S 三维培养24h后，用无菌注射器针尖轻轻将凝胶块与培养皿的周边部分分离，使胶原收缩并漂浮在培养液中，保持凝胶块的中心部分在整个培养过程中都贴附在培养皿的底部.在倒置显微镜下观察张力条件下凝胶块中VSMC
S 形态学变化.③活细胞染色及细胞计数:将用MTT（四甲基偶氮唑，Gibco公司）配成的染液适 量滴入培养液中，4h后，MTT被细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶还原成难溶性的蓝紫色结晶物，沉积在细胞内或细胞周围，使活细胞显蓝黑色，而死亡细胞则不着色.在倒置显微镜下逐个计数细胞，并以活细胞的百分率表示细胞活力（即每视野100个细胞的活细胞数）.胶原凝块用细菌胶原酶（4g・L-1 ，Sigma公司）消化成细胞悬液，用血球计数板在镜下行细胞计数.④统计学分析:所得资料应用t检验进行比较分析.
2 结果
2.1 三维培养的VSMCS 形态 含VSMCS 的胶原网形成时呈透明状态，凝胶化后变得不透明，并形成可被握持的凝胶块，粘附在培养皿的底部及四壁上.在倒置相差显微镜下，可清楚地看到各个层次的细胞及其形态.VSMCS 在凝胶中的位置固定，并分布于不同的层次，说明此时VSMCS 已经粘附在胶原支架上.约3～4h，呈圆形的VSMCS 表面逐渐伸展延长，形成多个胞质突起，呈星状（Fig3），表明VSMCS 已开始与胶原纤维发生粘着.扫描电镜下可见VSMCS 的胞质突起粘附在呈无续网状分布的胶原丝上（Fig4）.随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈现梭形、纺锤形（Fig5）. 2.2 张力作用下的细胞形态学改变 在凝胶与培养皿壁分离前，细胞生长无一定的方向性.当凝胶与培养皿壁分离时，凝胶块发生收缩，方向朝向中心部，在分离的瞬间，VSMCS 的胞质突起消失.随着时间的延长，细胞又逐渐出现胞质突起，但周边漂浮的凝胶块中的VSMCS 与贴附于器皿底的凝胶块中心中的细胞出现了不同的形态:周边部细胞以梭形、纺锤形，呈同心圆环状生长（Fig6）;中心部细胞生长与分离前无大的差异.伴随凝胶块的收缩，两部位的平滑肌细胞均变得愈加致密.有时互相交织呈网络.
2.3 细胞的活力与增殖 VSMCS 在胶原形成的基质中培养10d后，观察细胞的形态学改变和细胞计数结果表明:胶原凝胶中细胞数无增加.说明在三维培养系统中，VSMCS 并未出现增殖现象.同时MTT染色结果表明:三维培养的VSMCS 能够保持足够的活力（86±5，n=10）.与10d前接种当日（90±3，n=10）相比较，细胞活力无显著性差异.
3 讨论
VSMCS 的体外培养始于20世纪70年代［3］ .它将血管中膜的VSMCS 从体内复杂的影响因素中分离，并置于一定控制因素的直接作用下，连续、直接地观察和研究活细胞的形态结构、细胞活动、生长增殖、物质代谢及其影响因素.然而，单层培养系统中的细胞呈二维方式生长，VSMCS 脱离了在活体状态下与细胞外基质共同构成的连续整体.近年来，大量研究表明，细胞外基质不仅在维持组织结构方面发挥重要作用，而且具有重要的生物学特性.细胞与细胞外基质相互依存，相互作用，才能维持细胞的正常形态，进行正常的代谢，增殖、分化、迁移及信号传递［4］ .因此，将VSMCS 培养在胶原这种细胞外基质成分中，使之构成一个整体，在模拟活体血管组织的环境中表达各种生物学特性，使体外研究结果能更加真实地反映体内情况，结果也必定具有更为重要的参考价值.
图1 －图6 略
胶原是细胞外基质最基本的结构，它以支架形式为细胞和其他细胞外基质成分提供结合部位.鼠尾腱胶原在结构和抗原性方面与人体组织的I型胶原基本相同，它的来源广泛，成分较为单一，制备较方便，VSMCS 在该基质中能长时间地保持活力，故被选用作为培养基质.
VSMCS 的形态学变化充分反应了细胞与胶原纤维相互作用的过程.在早期，由于纤维排列的多向性，VSMC
S 的胞质沿纤维运动并产生多向性突起，使细胞呈星状.随着两者的相互作用，纤维发生改构，其排列逐渐由多向性转变为单向性，VSMCS 的胞质突起也随之表现为双极性，细胞呈梭形，较单层培养系统中的细胞更具立体感.同时，在三维系统中，尽管存在血清的刺激作用，但因VSMCS 受到胶原基质的抑制作用，所以生长增殖为相对静息状态.
含VSMCS 的胶原网架在一定浓度血清存在时可发生收缩反应［5-7］ .我们利用凝胶块的周边部分漂浮并发生收缩，使周围游离开的部分向中心聚集，产生张力作用.结果VSMCS 排列方向与此张力作用的方向垂直，表明细胞外基质的收缩影响了VSMCS 的形状和排列;VSMCS 的形状和排列与其所受的张力的方向存在密切关系.
国内有关三维培养系统的研究，多运用成纤维细胞，而国外细胞外基质多采用纯化Ⅰ型胶原，关于以鼠尾胶为支架的VSMCS 三维培养研究未见报道.应用三维细胞培养系统研究VSMCS 生物学行为具有良好的临床应用价值.由于这一系统可以将细胞、细胞外基质以及参与血管形成过程的一些调控因素如激素、生长因子、各种药物等构成一个有机整体，从而使实验结果能更加真实地反映活体血管组织中膜的生物学特性，所以这一培养系统的应用和发展对组织工程化血管的研究将产生积极的影响.
参考文献
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