作者：王吉村 药立波 吕厚山 刘新平 赵锦荣 邓艳春 孙铁铮 聂晓燕
【关键词】 关节炎
关键词: 关节炎，类风湿;滑膜细胞;PCR
摘 要:目的 筛选类风湿性关节炎（RA）滑膜细胞中的高表达基因，以探讨RA滑膜细胞发生肿瘤样增殖和侵蚀软骨的分子机理. 方法 以骨性关节炎（osteoarthritis，OA）滑膜细胞作对照，采用差示PCR（differentially display PCR）方法，克隆RA滑膜细胞中高表达的cDNAs片段，经反向点杂交排除假阳性克隆后，将阳性克隆进行基因序列分析. 结果 共回收76个差异条带，得到42个有插段的克隆，经反向点杂交后得到22个阳性克隆，对其中19个克隆进行基因序列分析表明，最长片段为501bp长，最短片段为145bp长，大部分在300bp.有13个克隆为已知基因，其中包括组织蛋白酶，其它6个克隆为未知序列，这些未知序列中除一个序列外都为基因的非编码区. 结论 差示PCR方法在筛选差异表达基因方面存在着很大的局限性;组织蛋白酶B可能与RA滑膜细胞的软骨侵蚀性有关.
Keywords:arthritis，rheumatoid;synovial cells;PCR
Abstract:AIM To simultaneously identify several genes whose expression increase in fibroblast-like synovial cells（FLS）of rheumatoid arthritis（RA）patients and to be relat-ed to the proliferation or invasion of FLS to cartilage of RA patients.METHODS Total RNAs were prepared separately from FLS of RA patients and osteoarthritis（OA，as control）patients.The RNA samples were analyzed by using differen-tially display reverse transcription polymerase chain reaction（DDRT-PCR）.Complementary DNA（cDNA）fragments corresponding to differentially expressed messenger RNAs（mRNAs）were eluted，cloned，and sequenced.The obtained sequences were compared with those genes which entered into EMBL/Genebank database.RESULTS Seventy-six differ-entially displayed fragments were obtained，but only55%（42/76）were successfully cloned into plasmid vectors.Re-verse dot-blotting hybridization showed that of the42clones，only22clones were truely positive.The sequence analysis of the19clones showed that，their lengths were from145bp to501bp，most of which were about300bp in length.13se-quences corresponded to known mRNAs，including cathepsin B.The other six sequences corresponded to transcripts of yet-unidentified genes.Most of the novel sequences were too short and were not in the coding regions of mRNAs.CON┐CLUSION DDRT-PCR method has many limitations on screening differentially expressed genes;cathepsin B might be related to the invasion of FLS in RA patients.
0 引言
在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）中，关节内滑膜细胞（fibroblast-like synovial cells，FLS）的过度增生和对软骨的蚕食性破坏是造成关节畸形的根本原因［1，2］ ，所以研究滑膜细胞发生这些病变的机理及找到控制病变的关键环节对于阻止RA患者发生关节功能障碍具有重要意义.为了研究RA滑膜细胞发生病变的细胞内机制，我们采用梁鹏等［4］ 设计并改进的差异显示PCR方法（DD-PCR），并以骨性关节炎（osteoarthritis，OA）患者滑膜细胞为对照筛选RA滑膜细胞中的高表达基因.以骨性关节炎（OA）滑膜细胞为对照的依据有三:①正常滑膜细胞很难原代培养;②骨性关节炎不主要表现为滑膜细胞的过度增殖侵袭性;③国外文献中此类研究常以骨性关节炎滑膜细胞作对照［3］ .
1 材料和方法
1.1 材料 类风湿性关节炎患者滑膜细胞和骨性关节炎患者滑膜细胞由北京医科大学人民医院骨关节中心提供，质粒载体pGEM ○R -T easy vector System I购自Promega公司，反转录酶SUPERSCRIPTTM II RNase H-Reverse Transcriptase和总RNA提取试剂TRIZOL○R Reagent购自Gibco BRL公司，DD-PCR试剂盒RNAimageTM Kit1购自GenHunter Corporation公司，核酸胶回收盒Nucleo Trap Gel Extraction Kit购自Clontech公司，PCR仪PE-9600:PE公司，测序电泳装置:Bio-Rad公司，自动序列分析仪PE310:PE公司，磷屏及扫描分析系统:Pharmacia公司.
1.2 提取总RNA 将培养的RA和OA各1例患者滑膜细胞（2×105 ）分别在TRIZOL裂解液（1mL）中直接裂解，然后向裂解液中加入0.2mL氯仿，震荡混匀后4℃下离心，12000g15min，取上清，加入0.5mL异丙醇，室温放置10min后离心，4℃12000g10min，沉淀用75mL・L-1 乙醇洗涤，晾干后溶于10μL去离子水中.
1.3 反转录 用SUPERSCRIPTTM II反转录酶进行反转录，反转录引物有3条，分别为H-T11 A（5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’），H-T11 C（5’-AAG CTTTTTTTTTTTC-3’）和H-T11 G（5’-AAGCTT TTTTTTTTTG-3’），所以对于每组（RA和OA）总RNA分别进行3组反转录，得到3组cDNA，两组样品总RNA量分别为0.4μg.
1.4 PCR扩增反应 将DD-PCR试剂盒中5’引物（H-AP1:5’-AAGCTTGATTGCC-3’，H-AP2:5’-AAGCTTCGACTCT-3’，H-AP3:5’-AAGCTTT GGTCAG-3’，H-AP4:5’-AAGCTTCTCAACG-3’，H-AP5:5’-AAGCTTAGTAGGC-3’，H-AP6:5’-AAGCTTGCACCAT-3’，H-AP7:5’-AAGCT-TAACGAGG-3’，H-AP8:5’-AAGCTTTTAC-CGC-3’）和3’引物（共3条，即以上的反转录引物）组合，分别对两组样品各3组cDNA进行PCR反应（每组24个反应），反应条件为94℃30s，40℃2
min，72℃30s，共40个循环，反应前94℃预变性 30s，反应后72℃延伸10min.
1.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 向20μL PCR产物中加入12μL上样缓冲液，80℃2min，迅速冰浴，然后上样.恒压1700V，电泳6h.
1.6 放射自显影 电泳结束后，将上层玻璃板卸下，将一张大滤纸盖在胶上，使后者吸附在滤纸上，将二者从板上取下，在胶的另一面盖上保鲜膜.在暗室里压上X线片，同时将滤纸和X-线片剪个豁口，以便以后对位切胶.将压片盒放-80℃，24h，显影.
1.7 胶块回收 将X线片和凝胶按标记切口对准，对照X线片上的差异条带，切下相应位置的胶块，放入1.5mL的离心管中，12000g离心2min，使胶块沉至管底，加入100μL去离子水，放30min，然后100℃煮15min，12000g离心2min，转移上清到另一个离心管中，加入10μL3mol・L-1 NaAc pH5.2，450μL无水乙醇，1μL10g・L-1 糖原，-20℃放30min，13000g离心10min，沉淀用85mL・L-1 乙醇洗涤，凉干后溶于30μL去离子水中.
1.8 重扩增及克隆 取上述回收产物5μL作为模板，进行重扩增，PCR条件同前.将以上重扩增产物回收并连入pGEM○R -T easy载体，转化大肠杆菌.挑取阳性克隆，进行酶切鉴定.
1.9 反向点杂交 为进一步验证克隆中的插段是否为差异表达cDNAs，将含有插段的质粒变性后点样于硝酸纤维素膜上，真空干燥固定后与α-32 P标记的对照组OA cDNAs探针杂交，68℃18h.严谨条件下洗膜后，压磷屏扫描.
1.10 阳性克隆的序列分析 对阳性克隆进行测序，然后将序列与Genebank中已有基因进行同源性比较（BLAST分析），以确定其是已知基因还是未知序列.对于未知序列，再进行局部碱基组成复杂性分析（local composition complexity，LCC）和开放读框分析（open reading frame finder，ORF finder），以判断其是否为蛋白编码区.
2 结果
2.1 差异条带的显示 Fig1为在变性聚丙烯酰胺凝胶（PAG）上显示的部分差异条带，与其他条带相比，这种差异具有可比性.
2.2 差异条带的重扩增及克隆 将以上差异条带回收后重扩增，对76个差异条带的重扩增效率约为80%（62/76）.将这些重扩增产物与载体连接，经酶切鉴定得到42个有插段克隆.Fig2为部分片段的重扩增产物.
2.3 反向点杂交 多个有插段的质粒与OA探针的膜杂交结果见Fig3，图中阳性信号的克隆即为假阳性克隆.通过杂交，共排除假阳性克隆20个，得到阳性克隆22个.
图1 － 图2 略
2.4 阳性克隆的序列分析 序列分析表明，这19个片段中最长的片段为501bp，最短的片段为145bp，大部分在300bp左右.它们中有已知基因13个，占68.4%，未知序列6个占31.6%.已知基因中，2个为线粒体细胞色素氧化酶C，3个为NADH还原酶基因，还有一个核糖体蛋白、热休克蛋白70、辅酶Q结合蛋白、sin3-相关蛋白、18S rRNA和组织蛋白酶B基因.其他克隆G42，G45，C47，C428，C439和A45为未知序列（Tab1）.
图3 略
表1 对19个克隆的BLAST分析 略
LCC分析显示，在这六个未知序列中只有C428序列大部分区域碱基组成复杂性高，有编码区.ORF分析显示，C428序列内有一编码39个氨基酸的完整读框（133～252bp），此氨基酸序列与Genebank中的所有已知蛋白均不同源，以下为C428克隆的序列:5’TTTTTTTTTCAAAATCCCATTATATCC ACTTCTCTTTGCTCCATCAACTTTTAAATGG CCTTTGGCCAAACGCCATAAAACACTGACCT AAAGATTGCTGCTCGCTCTTAACTGTGTCCT GAAATAGTTTTAATGGAACTTAGAACCTCA AAGACTCTCAGGGTTAGGAAGGATCTCCAA TGCCATGTAATTCAACTTCCCTTCCCCTCAT CCAACATCTATGACATCTGCAAGTCATCACT AAGATTTTAGTGAAAACCCCCTAGTGATAA AGACATCACTGCCTCAAGAGACAGCTAAC TTTCAGACAGCTGCCACAAAAGTTAGAGC AGTTGTTAAGAAGCCATGGAATATCTCCC TAGAAAGAAGCAGATGTTCTTGACTCATT TTTAAACATAGAATATGCAATCATGTTTA AGAAAACAACTTAAAAGCTCAGCCACATC CCATCTTTACTC-3’.
3.1 关于DD┐PCR方法 梁鹏等人设计的第三代DD-PCR引物中，5’端引物为8种，3’引物仍为3种，它们的组合（共24组）将覆盖所有的mRNA序列［4，5］ ，所以理论上讲，PCR可以扩增出细胞内所有的基因片段.
本研究采用这一体系筛选RA滑膜细胞中高表达基因发现，此方法有一些优点，但也有很大的局限性.优点是，可以同时显示全部差异基因，一目了然;可以同时比较两组以上的生物状态的差异.但此方法的局限性是多方面的:首先，假阳性率高.反向点杂交显示，42个克隆中假阳性克隆有20个，假阳性率接近50%;其次，此方法对高拷贝数的基因有很强的倾向性，15个已知基因中有2个为线粒体细胞色素氧化酶C基因，3个为NADH还原酶基因（这些克隆均无相同序列，非相同克隆），可能是因为这两类酶基因在细胞中有大量拷贝;还有，此方法获得的片段太短，片段提供的信息太少.这19个片段中，最长的为501bp，最短的为145bp，多为基因的非编码区，即使是新序列，其意义也很有限，必须通过进一步的EST拼接或筛选cDNA文库或用3’RACE法得到全长基因，才能判断其功能和意义.
3.2 克隆的已知基因与RA发生及滑膜细胞病变的关系
3.2.1 热休克蛋白70（hsp70） 研究发现，很多种自身免疫性疾病及相关动物模型都与对HSP的免疫性有关，这可能是因为哺乳类HSP70与微生物类的同源性很高，使肌体在感染过细菌HSP70后，发生 对自身HSP的交叉免疫反应.本研究表明，RA中滑膜细胞高表达HSP70，这与Schett等［6］ 用免疫组化研究的结果一致，他们认为，这是由于在炎症因子或切力作用下，滑膜细胞细胞内热休克蛋白因子-1的转录活性增高所致.但其表达增高是否具有保护自身细胞或进一步诱导自身免疫的作用目前尚不清楚. 3.2.2 组织蛋白酶B 组织蛋白酶B是一种广谱蛋白酶，它可分解多种细胞间质蛋白，研究表明，组织蛋白酶B和L参与RA关节破坏.Lemaire等［7］ 研究也发现，在一些细胞因子刺激下，滑膜细胞选择性分泌组织蛋白酶B和L，所以RA患者滑膜细胞高表达组织蛋白酶B可能是受炎症因子刺激所致.高表达和分泌组织蛋白酶B可能是RA滑膜细胞表现有软骨侵蚀性的一个重要原因.
参考文献
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