作者：楚东岭 宋俊峰 饶志仁 邱建勇
【关键词】 感觉神经节
关键词: 哮喘;感觉神经节;P物质;免疫组织化学
摘 要:目的 探讨豚鼠哮喘后颈静脉节和结状节P物质（SP）表达变化. 方法 成年雄性豚鼠随机分为正常组和哮喘组，采用免疫组织化学法观察豚鼠颈静脉节和结状节SP免疫反应神经元的变化. 结果 哮喘组颈静脉节和结状节SP免疫反应神经元数量发生了显著变化，哮喘组与正常对照组比较颈静脉节和结状节SP免疫反应神经元数量显著增加（P&<0.01）. 结论 哮喘发病与颈静脉节和结状节SP免疫反应神经元密切相关，可能是导致哮喘持续发病的原因之一.
Keywords:asthma;sensory ganglion;substance P;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate the changes in SP immunore-active neurons in the jugular tubercle and nodose ganglion of asthmatic guinea pigs.METHODS Immunohistochemistry was used in this study.RESULTS There was a significant increase in the numbers of SP immunoreactive neurons in the jugular tubercle and nodose ganglion of asthma group（P&<0.01）.CONCLUSION There is close relationship between SP immunoreactive neurons in the jugular tubercle or nodose ganglion and attack of asthma.It may be a reason for persis-tence and progress of asthma.
0 引言
人们很早就注意到神经因素在哮喘发病机制中的作用，尤其是感觉神经与哮喘的关系越来越受到学者关注.研究［1-3］ 发现，P物质（substance P，SP）、神经肽A（neurokinin，NKA）、降钙素基因相关肽（cal-citonin gene-related peptide，CGRP）等神经肽类可以引发气道神经源性炎症，包括气道平滑肌收缩、血管通透性增加和炎性细胞浸润.研究发现哮喘患者支气管肺泡灌洗液（BALF）中SP，CGRP浓度均显著高于健康人群水平，特别是在急性发作时，SP和CGRP浓度进一步升高.同时有文献［4，5］证明哮喘发作时肺内SP和CGRP免疫反应阳性神经纤维数目和分布状态均发生非常明显的变化.而哮喘时肺内感觉传入神经胞体所在主要部位 结状节和颈静脉节SP表达的变化如何尚不清楚.我们应用免疫组织化学方法观察了哮喘豚鼠结状节和颈静脉节SP的表达变化，为阐明哮喘发病机制提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性豚鼠20只，体质量（300±50）g，由第四军医大学实验动物中心提供.随机分为2组，即哮喘组和对照组，每组10只.
1.2 方法
1.2.1 复制豚鼠哮喘动物模型 实验的前1日腹腔内注射100g・L-1 卵白蛋白（Sigma）1mL;第10日开始吸入10g・L-1 卵白蛋白气溶胶30min，1次・d-1 ，连续14d.对照组用生理盐水代替卵白蛋白.
1.2.2 取材 于实验第24日以戊巴比妥钠（40mg・kg-1 ，ip）麻醉豚鼠，开胸经主动脉灌注100mL生理盐水，继以新配制的4℃40g・L-1 多聚甲醛加PB溶液（0.1mol・L-1 ，pH7.4）500mL持续灌注90min，取出结状节和颈静脉节，入200g・L-1 蔗糖PB溶液中，4℃过夜.
1.2.3 免疫组织化学染色 恒冷箱切片，片厚14μm，贴片于10g・L-1 明胶加50mg・L-1 硫酸铬钾处理过的载玻片上，室温干燥30min后，以0.01mol・L-1 PBS（pH7.4）浸洗，经800mL・L-1 甲醇加30mL・L-1 h3 O2 封闭10min，入30mL・L-1 Triton X-100中30min，KPBS浸洗3×10min，切片入兔抗SP血清（1∶4000，Oncogene Science），室温孵育24h.KPBS浸洗3×10min，入结合生物素的羊抗兔IgG血清（1∶500，Sigma），室温孵育3h，KPBS浸洗3×10min，入ABC复合物（1∶500，Sig-ma）室温孵育2h.葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色.显色反应终止后，常规脱水透明，DPX封片.光学显微镜下观察照像.替代实验在各组切片中随机抽取切片，以KPBS代替一抗，其余步骤相同.
统计学处理:以肺内气道为分析对象，显微镜下行图像分析，测量单位玻片面积内SP-IR阳性细胞数.按x ±s进行两组间t检验.
2 结果
2.1 对照实验 替代实验未见有意义的染色.
2.2 正常对照组感觉神经节SP┐IR细胞分布 在结状节仅有极少量SP阳性标记细胞分布（Fig1），在颈静脉节则相对较多，SP主要表达于胞质中.
2.3 实验组感觉神经节SP┐IR细胞分布 在结状节（Fig2）和颈静脉节（Fig3）的SP阳性标记神经元较正常对照组明显增多，表达SP的阳性纤维也较多（Fig4）.
图1 －图4 略
2.4 感觉神经节内SP┐IR细胞记数 哮喘组结状节和颈静脉节的SP阳性标记神经元分别为（13±3）个・mm-2 和（35±7）个・mm-2 ，较正常对照组的（8±2）个・mm-2 和（18±4）个・mm-2 明显增多，两者相差显著（P&<0.05）.
3 讨论
呼吸道中60%的感觉神经随迷走神经走行，其胞体位于颈结状节和颈静脉节，后者发出中枢突随迷走神经根终止于孤束核、极间核（nucleus inferpo-laris）、三叉神经尾侧亚核以及颈髓背角浅层;另外，约40%的感觉传入经C7-T5脊神经节、交感神经颈上节分别传入脊髓背角浅层以及孤束核内.其神经纤维主要是Aδ，C类纤维，在正常呼吸道主要分布于粘膜下层和外膜层，其神经肽为SP，NKA和CGRP.在哮喘动物模型及患者的血液和BALF中发现有异常数量的SP，NKA等感觉神经肽［6-8］ ，而SP又可以引起哮喘样的炎性反应，因此认为肺内感觉神经末梢释放异常量的神经肽与哮喘发作有密切关系.相应的实验［4，5］ 表明，哮喘发作时肺内SP和CGRP免疫反应阳性神经纤维数目增加，分布状态也发生非常明显的变化.
现在认为神经的营养、生长和功能改变是与神经生长因子（nerve growth factor，NGF）密切相关的，因此哮喘发生时感觉神经节内神经元的这种变化与NGF有何种关系是我们必须要考虑的问题.有关NGF与肺内周围神经纤维的关系已有大量的证据［10-12］ .Annick等［13］ 发现静脉直接给予NGF30min～3h后能提高组胺诱发的气道收缩幅度达200%，并且这种增强效应可为速激肽-1受体拮抗剂完全拮抗.进一步发现NGF在患者血液以及BALF中浓度的升高是因为IgE介导的肥大细胞中NGF的大量释放的结果［14］ .这提示哮喘发生时神经功能的改变可能与免疫炎性反应相关.
据此我们推测哮喘时气道各种炎性因子促进炎性细胞释放NGF，BDNF等，进而导致气道感觉神经元兴奋性提高和神经纤维再生，而高度兴奋的感觉神经元可通过增加反射弧传入冲动、促进冲动传导和表达分泌SP等功能增加，进一步加重哮喘，如此恶性循环，导致哮喘迁延不愈.
参考文献:
［1］Lundberg JM，Franco-Coreceda A，Hua X，Hokfelt T，Fischer JA.Co-existence of substance p and calcitonin gene related pep-tide-like immunoreactivities in sensory nerves in relation to car-diovascular and bronchoconstricter effects of capsaicin ［J］.Eur J Pharmacol，1985;108（3）:315-319.
［2］Palmer JB，Cuss FM，Mulderry PK，Ghate MA，Springall DR，Cadieux A，Bloom SR，Polak JM，Barnes PJ.Calcitonin gene-related peptide is located to human airway nerves and potently constricts human airway smooth muscle ［J］.Br J Pharmacol，
1987;91（1）:95-101.
［3］Karlsson JA.Purines and sensory neuropeptides in human bull ［review］［J］.Eur Physiopathol Respir，1987;23（suppl10）:95s-101s.
［4］Wu CG，Mao BL，Sun B.The distribution of substance P in the lungs of asthmatic guinea pigs and the influence of dexametha sone on the distribution ［J］.Zhonghua Jiehe He Huxi Zazhi（Chin J Tuberc Respir Dis），1998;21（1）:16-18.
［5］Chu DL，Song JF，Rao ZR，Qiu JY.Changes of CGRP im-munoreactive nerve fibers in the lungs of asthmatic mice ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（13）:1168-1171.
［6］Spina D，Shah S，Hanison S.Modulation of sensory nerve func-tion in the airways ［J］.Trends Pharmacol Sci，1998;19（11）:460-466.
［7］Tomaki M，Ichinose M，Miura M，Hirayama Y，Yamauchi H，Nakajima N.Elevated substance P content in induced sputum form patients with asthma and patients with chronic bronchitis ［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995;151:613-617.
［8］Heaney LG，Cross LJ，McGarvey LP，Buchanan KD，Ennis M，Shaw C.Neurokinin A is the predominant tachykinin in human brochoalveolar lauid in normal and asthmatic subjects ［J］.Thorax，1998;53（5）:357-362.
［9］Hunter DD，Undem BJ.Identification and substance P content of vagal afferent neurons innervating the epithelium of the guinea pig trachea ［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999;159（6）:1943-1948.
［10］Hogle GW，Graham RM，Finkelstein JB，Nguyen KP，Gozal D，Friedman M.Hyperinnervation of airways in transgenic mice overexpressingnerve growth factor ［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1998;18（2）:149-157.
［11］Braun A，Lommatzsch M，Lewn GR，Lommatzsch M，Lewin GR，Virchow JC，Renz H.Neurotrophins:A link between air-way inflammation and airway smooth nuscle contractility in asth-ma ［J］?IntArch Allergy Immunol，1999;118:2-4，163-165.
［12］Virchow JC，Julius P，Lommatzsch M，Luttmann W，Renz H，Braun A.Neurotropins are increased in bronchoalveolar lavage fluid after segmental allergen provocation ［J］.Am J Respir Crit Care Med，1998;158（6）:2002-2005.
［13］Annick V，Mark CD，Ferdi E.Nerve growth factor induces a neurkinin-1receptor mediated airway hyperresponsiveness in guinea pigs ［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999;159（5）:1541-1544.
［14］Xaing Z，Nilsson G.IgE receptor-mediated release of nerve growth factor by mast cell ［J］.Clin Exp Allergy，2000;30（10）:1379-1386.