【关键词】 毛细胞
关键词: 毛细胞，前庭;蛋白激酶C;器官培养;佛波酯
摘 要:目的 观察体外培养条件下蛋白激酶C（protein ki-nase C，PKC）在佛波酯（phogrbol12-myristate13-acetate，PMA）诱导下大鼠前庭上皮的表达和分布特点. 方法 取新生大鼠椭圆囊，建立体外前庭器官培养模型，采用免疫组织细胞化学的方法，以PKCβ，γ抗体为标记物，检测PMA诱导后前庭上皮PKCβ，γ的表达变化和分布特点. 结果 PKCβ，γ在正常培养新生大鼠前庭上皮细胞的细胞膜及细胞质中有弱表达.PMA作用后，其表达逐渐增多，PKCβ1 主要位于细胞膜，在30min时表达最强，其后逐渐减少，45min仍高于正常（P&<0.01）.PKCβ2 不但位于细胞膜，而且在纤毛亦明显表达;PKCγ在PMA诱导后胞质表达增加.在毛细胞层和支持细胞层均有，主要位于毛细胞层. 结论 体外前庭器官培养在PMA诱导后，PKC各亚型激活的形式及程度不同.
Keywords:hair cells，vestibular;protein kinase C;organ culture;phogrbol12-myristate13-acetate
Abstract:AIM To investigate the expression of PKCβ，γof vestibular epithelium in rats after PMA treatment during or-gan culture in vitro so as to elucidate the biological character.METHODS The vestibular organ was placed in the bottom of a culture plate which contained culture medium to grow.After the initial culture period of24h，the explant was incu-bated with PMA for different periods of time.The expres-sions of PKCβ1 ，β2 ，and PKCγwere determined by anti-PKCβ1 ，β2 ，and PKCγwith immunocytochemistry.RESULTS In the normal cultured vestibular epithelium of new born rats，the levels of expression of PKC were low in the control groups.In the experimental groups，PKC levels were elevat-ed significantly and increased to the peak at30minutes.Then the levels decreased gradually，but at45minutes they were still increasing compared with the normal.PKCβstaining was detected in cell membranes，PKCβ2 ，not only stained in cell membranes but also in cilia，PKCγstaining increased in cell cytoplasm.CONCLUSION During organ culture in vit-ro，the expressions of PKCβ，γof vestibular epithelium in rats after PMA treatment increased，which suggests that the iso-form of PKC may have different forms of and different activa-tion，isoform may function differently.
0 引言
蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是一类钙离子-磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号转导过程中起着十分重要的作用，其通过催化多种蛋白质上的ser/thr磷酸化调节细胞代谢、增殖、凋亡及分化.研究表明PMA可以刺激心肌细胞增殖［1］ ;能激活Raf-1-MEK-MAPK信号转导途径，引起ERK-2表达增加、细胞增殖［2］ .我们在建立体外前庭器官培养模型的基础上，采用免疫组织细胞化学的方法，以PKCβ，γ抗体为标记物，检测在PKC活化剂佛波酯（Phor-bol12-myristate13-acetate，PMA）诱导后前庭上皮PKCβ，γ的表达变化和分布特点，以探讨PKC在内耳的生物学特性及意义.
1 材料和方法
1.1 材料 新生2d的SD大鼠20只.雌雄不限，体质量（9.1±1.3）g，由第四军医大学实验动物中心提供.PKCβ1，2 ，γ亚型兔多克隆抗体（Santa Cruz公司）、SABC试剂盒、DMEM培养液、HEPES，DAB显色试剂盒（武汉博士德公司），PMA（Sigma公司），LEICA Q570图形分析仪（德国LEICA公司），培养箱（美国Sheldon公司），Hank’s液按配方配制［3］ .
1.2 方法
1.2.1 体外前庭器官培养模型的建立 按照Lam-bert方法［4］ ，冷冻麻醉后，无菌条件下断头，置于冰的Hank’s液中，解剖显微镜下取出椭圆囊，去除耳石，移入鼠尾胶包被过的24孔培养板中，加入适量DMEM高糖培养液（含HEPES、胎牛血清及青霉素）［5］ .放于37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱，每日在倒置显微镜下观察移植物色泽及培养液情况，隔日换液，1wk后经戊二醛固定，透射电镜下观察细胞生存情况.
1.2.2 实验分组及切片的制备 将大鼠分为3组实验组及对照组，每组5只，正常培养过夜稳定后，实验组加入PMA（100μg・L-1 ），分别培养15，30和45min后，40g・L-1 多聚甲醛固定12h，恒冷箱中OCT胶定向包埋标本，取与纤毛平行方向，LEICA恒冷箱切片机连续切片，厚度10μm.
1.2.3 免疫组化染色 采用SABC法.3mL・L-1 过氧化氢-甲醇室温30min，封闭内源性过氧化物酶;正常山羊血清封闭10min，甩去，不洗;一抗:PKCβ1，2 ，γ亚型兔多克隆抗体（1∶400，0.01mmol・L-1 PBS稀释）4℃冰箱过夜;二抗:生物化兔抗羊（1∶200），室温3h;SABC室温3h;DAB显色.以上步骤中间以0.01mmol・L-1 PBS缓冲液冲洗3次，每次5min.脱水、透明、封片.阴性对照以抗体稀释液代替一抗.
1.2.4 半定量分析 每只动物前庭组织连续切片，每隔6张取1张，用于半定量分析.使用LEICA Q570图形分析系统.切片在光镜下分析.阳性细胞的染色强度用灰度表示，像素灰度范围为0～150（0为灰色，150为白色）.椭圆囊斑感觉上皮区取5个单位面积测定灰度值.每次测量设定统一的光学条件，最后计算出每组动物感觉上皮区的平均灰度值.
统计学处理:所得数值用x ±s表示，用方差分析.
2 结果
2.1 前庭器官体外培养 体外培养椭圆囊1wk，培养期间观察培养物呈半透明状，无发黑，培养液无混浊，12h可见成纤维细胞沿移植物边缘游出，48h内皮细胞聚集，呈铺路石样，透射电镜观察细胞无肿胀，胞膜、胞核完整，线粒体嵴无肿胀，纤毛无脱落.
2.2 免疫组化
2.2.1 PKCβ1 免疫组化染色 PKCβ1 在正常前庭上皮细胞的细胞膜及细胞质中表达较弱（Fig1A），PMA作用后，15min表达无明显增加（P&>0.05），其表达逐渐增多，30min时表达明显增加（Fig1B），主要位于细胞膜，胞质中亦表达增强，纤毛无明显着色（P&<0.01）.45min仍高于对照组（P&<0.01，Tab1）.
表1 培养条件下大鼠前庭上皮细胞PKCβ，γ表达变化 略
2.2.2 PKCβ2 免疫组化染色 在正常对照组中PKCβ2 免疫组化染色稍高于PKCβ1 （Fig2A），PMA作用15min，其表达逐渐增多（P&<0.01），30min时表达明显增加（P&<0.01），主要位于细胞膜，纤毛着色明显（Fig2B），45min仍高于对照组（P&<0.01，Tab1）. 转贴于 2.2.3 PKCγ免疫组化染色 PKCγ染色结果显示与以上两组有所不同，正常对照组表达较弱，主要位于胞质（Fig3A），PMA作用后，各时间段PKCγ均高于对照组（P&<0.01），但程度较弱，染色位于胞质，胞膜、纤毛无明显改变，30min时表达见Fig3B（Tab1）.
3 讨论
器官培养是把器官原基放入近似体内环境的培养系统，保持原有组织之间的结构特征，人为控制培养条件，施加外在因素，可完成活体内无法完成的实验研究.不仅可以在体外研究内耳的发育，也可以用于生理病理机制的研究.
蛋白激酶C是一类钙离子―磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号转导过程中起着十分重要的作用，其通过催化多种蛋白质上的ser/thr磷酸化调节细胞代谢、增殖、凋亡及分化.到目前为止，在哺乳动物组织内已确定10种PKC亚类，分为3组.A组包括α，β1 ，β2 和γ亚类;B组包括δ，ε，η（L）和θ亚类;C组由ζ和λ亚类组成.PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞;静止细胞中PKC主要存在于胞质中，当细胞受到刺激后，PKC以Ca2+ 依赖的形式从胞质中移位到细胞膜上，此过程称之为转位.一般将PKC的转位作为PKC激活的标志.蛋白激酶C是促癌剂PMA的受体，其作用主要是促进细胞的增殖和分化，抑制细胞凋亡.许多实验表明PMA等蛋白激酶C活化剂能抑制细胞凋亡的发生.研究表明:恶性肿瘤细胞中蛋白激酶C的活性很高［6］ ，与肿瘤的生长有关;PMA可以刺激心肌细胞、SE细胞增殖［1，7］ ;PMA能激活Raf-1-MEK-MAPK信号转导途径，引起ERK-2表达增加、细胞增殖［2，8］ .
有关实验已证明，鱼类、两栖类及鸟类前庭毛细胞都能够再生，哺乳动物前庭毛细胞损伤后可以发生再生修复现象［9］ .Warchol等［10］ 在成年豚鼠前庭器官离体实验结果提示只要能够引起前庭感觉上皮损伤即可使其获得再生修复能力.PKC参与细胞增殖凋亡的机制与许多信息通路有关.Zheng等［11］ 研究发现FGF-2和IGF-1对于调节前庭上皮细胞再生具有重要作用，显示PKC与前庭毛细胞增殖凋亡有关，亦与耳蜗损伤后听觉神经元树突突触损伤修复有关［12］ .但在此过程中PKC激活调节机制尚未完全阐明.有研究显示:PKC在前庭外周损伤早期，前庭代偿中具有重要作用［13］ .体外培养鸡胚胎耳泡中，给予IGF-1和PMA，可引起磷酸化MAPK表达增高，加入PD098059（MAPK抑制剂）可抑制磷酸化MAPK的表达［14］ .Witte MC在研究鸡椭圆囊上皮体外培养中发现，细胞有丝分裂S期可被磷脂酰肌醇激酶（PI3-K）及MAPK的抑制剂所阻断，而值得注意的是，PKC抑制剂作用的阻断作用尤为显著［15］ .
图1 －图3 略
本研究表明，在健康新生鼠的前庭感觉上皮中，PKC表达很少，主要位于靠近细胞膜的细胞质中，PMA作用后，其表达明显增多，以30min时最多，主要位于细胞膜，PKCβ2 免疫组化染色稍高于PKCβ1 ，纤毛亦呈阳性反应，其后逐渐减少.45min时表达仍高于对照组.而PKCγ胞质表达增加，胞膜无明显改变.提示在PMA作用下，PKC各亚型激活的形式及程度不尽相同，各亚型在生理过程中可能发挥不同作用，PKC激活后如何参与前庭上皮的生理活动，尚需作进一步研究.
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