【关键词】 钙离子
关键词: 氯离子通道阻断剂;气管条;豚鼠;5-羟色胺;钙离子
摘 要:目的 研究氯离子通道阻断剂对豚鼠离体气管条收缩反应的影响及其作用机制. 方法 制备离体孵育的豚鼠气管条，分别在浴液中加入药物，测定KCl和5-羟色胺（5-HT）收缩气管条的作用以及氯离子通道阻断剂和维拉帕米（Ver）对KCl和5-HT作用的影响. 结果 两种氯离子通道阻断剂氮氟灭酸（NFA）和5-硝基-2-3苯酚丙胺苯甲酸盐（NPPB）均能使KCl或5-HT引起的气管条收缩显著抑制，解痉百分率分别为100%和30%，Ver的抑制效应位于NFA与NPPB之间，NFA，NPPB和Ver对细胞内Ca2+ 释放和细胞外Ca2+ 内流引起的收缩均有抑制作用. 结论 氯离子通道阻断剂NPPB和NFA可抑制KCl和5-HT引起的气管条收缩，其机制可能是氯离子通道阻断剂影响细胞钙运动.
Keywords:chloried channel blockers;tracheal strip;guinea pig;5-hydroxytryptamine;calcium anon
Abstract:AIM To study the effects and mechanisms of chloride channel blockers（NFA and NPPB）on the contrac-tion of isolated tracheal strips of guinea pigs.METHODS The incubated isolated tracheal strips of guinea pigs were pre-pared.Various drugs were added respectively.KCl or5-HT induced contractile effects and changes in KCl or5-HT caused by chloride channel blockers and verapamil（Ver）were deter┐mined.RESULTS The contractions induced by KCl or5-HT in isolated tracheal strips of guinea Pig were markedly in-hibited by NFA and NPPB.The depressed percentage were100percent and30percent，repectively.The inhibitory effect of Ver was intermidiate between the effects of NFA and NPPB.NFA，NPPB and Ver markedly inhibited the contrac-tions induced by Ca2+ released from an intracellular store and extracellular Ca2+ .CONCLUSION NFA and NPPB can sig-nificantly inhibit contraction of tracheal strips induced by KCl and5-HT and their mechanism may be that blocking chloride channel can affect transportation of Ca2+ .
0 引言
氯离子通道阻断剂5-硝基-2-3苯酚丙胺苯甲酸盐［5-nitro-2（3-phenylpropylamino）benzoate，NPPB］、氮氟灭酸（niflumic acid，NFA）属于单羧酸衍生物，近年的动物实验研究发现，NPPB，NFA等可抑制血管平滑肌的收缩反应［1］ .但NPPB，NFA对气管平滑肌的作用未见报道，我们观察了NPPB，NFA对豚鼠离体气管平滑肌收缩反应的影响，并与维拉帕米（verapamil，Ver）进行比较，探讨其作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 NPPB，NFA购自Sigma公司，5-羟色胺（5-HT）由第四军医大学药理学教研室招明高博士惠赠，用双蒸水配成溶液备用.实验灌流用克氏液（Kreb’s）含（mmol・L-1 ）:NaCl118.3，KCl4.7，CaCl2 2.5，NaHCO3 25.0，Kh3 PO4 1.2，MgSO4 1.2，葡萄糖11.1，用双蒸水配制，以HCl或NaOH调节至pH7.4.实验动物用豚鼠（第四军医大学实验动物中心提供）14只，体质量350～500g，雌雄不拘.
1.2 方法
1.2.1 标本制备 参照文献［2-4］报道的方法，豚鼠用铁锤击头处死，取出气管，置于玻璃皿中，在通O2 的Kreb’s液中，分离周围结缔组织，用一细玻棒穿入气管，将气管剪成约4mm×20mm的螺旋条，一端固定在玻璃钩上，另一端固定在张力传感器上，把气管条置于盛有8mL Kreb’s液浴槽中，通以950mL・L-1 O2 +50mL・L-1 CO2 的混合气体，温度保持在（37±0.5）℃，静止张力维持1g，每30min换液1次，平衡2h后开始给药.气管条收缩张力通过张力传感器记录于多道生理记录仪上.
1.2.2 NFA和NPPB对气管条收缩的作用 气管条在浴管中平衡2h后，在浴液中加入KCl或5-HT，使其终浓度分别为40mmol・L-1 或1×10-4 mmol・L-1［5］ 致气管条收缩，当气管平滑肌张力升到高点时，用药组标本加入NFA（终浓度50μmol・L-1 ）或NPPB（终浓度50μmol・L-1 ），对照组加入同体积生理盐水，观察比较各组标本给药后3min曲线下降幅度，并按下式求得解痉百分比:解痉百分比=（给药前曲线高度-给药后曲线高度）÷给药前曲线高度×100%.
1.2.3 氯离子通道阻断剂和维拉帕米对气管条两种收缩组分的作用 气管条在浴液中平衡稳定后，用无Ca2+ （不加CaCl2 ，加50μmol・L
-1 的EDTA）的Kreb’s液反复冲洗标本，稳定30min后，在无Ca2+ 浴液中加入100nmol・L-1 的5-HT，待气管条产生依赖于细胞内Ca2+ 钙池释放性收缩达峰值后，立即加入2.5mmol・L-1 CaCl2 ，气管收缩张力再次升高，此系5-HT引起的细胞外Ca2+ 内流所致的依赖外Ca2+ 性收缩，以两次收缩累积上升的张力之和为100%（即Emax ）.用Kreb’s液反复冲洗6次后，气管条舒张，回到基线，待基线稳定后，在无Ca2+ 液中加入NFA或NPPB使终浓度达50μmol・L-1 ，10min后再加入100nmol・L-1 5-HT，重复测定无Ca2+ 和加Ca2+ 后气管条收缩峰值（即E），比较加药前后两种收缩占Emax 的百分率（即E/Emax %），计算收缩抑制率:［1-（加药后的E/Emax %÷加药前的E/Emax %）］×100%.5×10-5 mol・L-1 Ver作用测定方式与氯离子通道阻断剂相同.
统计学处理:实验数据以x ±s表示，用药组给药前后比较用配对t检验，组间比较用两组t检验.
2 结果
2.1 NFA，NPPB和Ver对KCl和5┐HT收缩气管条的影响 终浓度为40mol・L-1 KCl可引起气管条迅速收缩，对照组收缩达峰值后30min内保持一定高度不变.分别加入4μL NPPB，NFA（终浓度均 为50μmol・L-1 ）和Ver（终浓度50μmol・L-1 ），3min后测量曲线高度，NFA组完全回到基线附近，Ver组下降幅度次之，NPPB组下降最少（Tab1）.在浴液中加入5-HT8μL（终浓度为100nmol・L-1 ）获得气管条收缩曲线后，分别加入4μL NPPB，NFA和Ver（终浓度均为50μmol・L-1 ），3min后曲线下降幅度与加KCl时相似（Tab2）.生理盐水对收缩作用无影响.
表1 NPPB，NFA对KCl所致豚鼠离体气管条收缩的影响 略
表2 NPPB，NFA对5-HT所致豚鼠离体气管条收缩的影响 略
2.2 氯离子通道阻断剂和Ver对5┐HT引起的两种收缩组分的影响 在无Ca2+ Kreb’s液中加入5-HT后引起气管条快而短暂的收缩，达峰值后立即加入CaCl2 2.5mmol・L-1 ，可见气管条产生慢而持久的收缩.加入NFA，Ver对无Ca2+ 收缩有明显抑制作用（P&<0.01），而NPPB对无Ca2+ 收缩无明显抑制作用，加入NFA，NPPB和Ver对加Ca2+ 后的收缩均有明显抑制作用（P&<0.01，Tab3）.其抑制率在无Ca2+ 液时，NFA为（100.0±0.5）%，NPPB为（7.1±2.7）%，Ver为（53.3±3.8）%;加Ca2+ 后NFA为（100.0±2.5）%，NPPB为（48.7±3.5）%，Ver为（51.5±7.6）%.总的抑制率NFA为（100.0±3.0）%，NPPB为（31.4±4.5）%，Ver为（51.8±8.2）%. 表3 氯离子通道阻断剂和维拉帕米对豚鼠离体气管条两种收缩组分的作用 略
3 讨论
近年来的研究发现，氯离子通道在非兴奋性细胞中的作用十分重要.它起着调控细胞膜电位，影响细胞吸收功能，参与体液调节和信号转导等作用［6，7］ .氯离子通道在受体激活触发的Ca2+ 调控中所起的作用引起人们的重视［8］ .另外，据报道胞内Ca2+ 释放可激活此类氯离子通道［9］ ，ATP可触发一种Ca2+ 依赖性氯电流，这种电流可被氯离子通道阻断剂NFA及DIDS等抑制［10］ .说明Ca2+ 与氯离子通道关系密切，氯离子通道阻断剂的作用与Ca2+ 也密不可分.
NFA，NPPB是单羧酸类氯离子通道阻断剂，本实验中观察到，在标本的浴液中加入NFA和NPPB，可对5-HT和KCl引起的豚鼠气管条收缩有明显的抑制作用（P&<0.01），且NFA的作用较NPPB快而强，NPPB作用稍慢，但较NFA持久.本实验所测结果均是加药3min后测得的结果，NFA加入3min，NPPB加入约40min后，两者抑制率均可达到100%，对照组2h后曲线才逐渐回到基线水平.从溶液中去除NFA和NPPB后，可使气管条的收缩活性逐渐恢复，可见这种抑制作用不是药物本身的细胞毒性所致.
Ver对电压依赖性钙通道（PDC）有较高的选择性抑制作用，实验中气管条产生高钾去极化引起收缩的作用是Ca2+ 依赖性的，5-HT引起平滑肌收缩也需要Ca2+ 参与［11］ ，Ver能使气管条的收缩得到抑制与其抑制平滑肌细胞内的Ca2+ 增多和作用有关.Ca2+信号的调控一直备受关注，那么氯离子通道对于 Ca2+ 介导的平滑肌收缩有否影响?细胞内Ca2+ 升高分为早期Ca2+ 释放和持续Ca2+ 内流，有证据表明NFA可影响多种细胞的早期Ca2+ 释放［12］ ，提示NFA抑制气管平滑肌收缩的机制可能是影响Ca2+ 释放从而间接抑制胞外Ca2+ 内流.目前认为NPPB，从严格的定义上讲，它不是氯离子通道阻断剂，而是一种通道“阐门”调节物，根据膜电位的变化来调节通道的“开”“关”频率［13］ ，高浓度的NPPB可减少氯离子通道的开放时间，继而减少氯内流.本实验中NPPB的终浓度为50μmol・L-1 ，已能有效地抑制平滑肌的收缩了.NPPB可直接阻抑Ca2+ 池耗竭激发的Ca2+ 内流，导致胞内Ca2+ 降低［14］ ，对持续Ca2+ 内流有抑制作用.本实验中，无钙浴液中5-HT不仅可促进细胞内Ca2+ 释放，致使气管条收缩，还可以开放受体操纵性通道（ROC），此时恢复浴液内Ca2+ 浓度，引起气管条进一步收缩是细胞外Ca2+ 经ROC内流的结果.NFA可同时抑制5-HT激活的细胞外Ca2+ 内流和细胞内Ca2+ 释放，表现出较强的抑制气管条平滑肌收缩的活性.NPPB主要对Ca2+ 内流有明显的抑制作用，所以其抑制气管条收缩的作用较NFA缓慢而持久.
以上说明阻断氯离子通道的开放，对气管平滑肌细胞Ca2+ 运动有抑制作用，其抑制平滑肌收缩可能是改变了与Ca2+ 有关的平滑肌收缩活性，但其确切机制尚有待进一步证实.是否还存在其他可能的机制，目前尚不确定.因为这些氯离子通道阻断剂对氯离子通道的阻断作用缺乏特异性，表现在它们对其他离子通路也有作用，如NPPB可抑制非选择性阳离子通道［15，16］ .
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