作者：史皆然 李元 戚好文 李别虎 柏银兰 范雄林 薛莹
【关键词】 尘螨抗原
关键词: 尘螨抗原;基因;克隆;表达
摘 要:目的 构建并克隆屋尘螨抗原Der p2基因，在大肠杆菌中初步表达. 方法 根据已发表的Der p2基因，人工设计合成一系列基因片段，经单链扩增后连接成完整的Der p2基因;将该基因克隆入表达载体pProEX HTb中，测序并进行初步表达. 结果 利用所设计的结构制备了完整的Der p2基因，以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得初步表达，该外源蛋白Mr 约为17×103 ，占总蛋白量的20%. 结论 所构建的Der p2基因能在大肠杆菌中表达.
Keywords:dust mite antigen;gene;cloning;expression
Abstract:AIM To construct and clone the gene of the house dust mite antigen Der p2，which is expressed in E.coli.METHODS The gene fragments were designed and synthesized by the published house dust mite antigen Der p2.Using single chain amplification by PCR and T4ligase，we prepared the whole Der p2gene，which was cloned to express vector pProEX HTb for sequence analysis and expression.RESULTS The whole Der p2gene was constructed with designed structure and expressed by IPTG inducement in E.coli.The Der p2protein was detected to be about Mr 17×103 by SDS-PAGE.The yield account for up to20%of the total amount of protein.CONCLUSION The constructed Der p2gene can be expressed in E.coli.
0 引言
屋尘螨（house dust mite，HDM）抗原是一种重要的空气变应原，在临床上引起哮喘、皮炎等多种超敏反应性疾病［1］ .Der p2是屋尘螨抗原中的重要成分，最早从学名为Dermatophagoides pteronyssinus的螨虫体内分离，编码Der p2的cDNA于1990年克隆［2］ .现已证实Der p2的一些表位为小鼠和人类T细胞所识别.将Der p2基因转入卡介苗（bacillus calmette-guerin，BCG）中，制备抗原肽基因重组BCG疫苗，有可能成为预防哮喘等过敏性疾病的新途径.为此，我们采用基因分段合成连接的方法，构建了完整的Der p2基因，并进行了初步表达.
1 材料和方法
1.1 材料 限制性内切酶，X-gal，IPTG，dNTP，pMD18-T Vector，DNA Marker DL2000购自Takara公司;Taq DNA聚合酶，pGEM-T-easy Vec-tor Kit为Promega公司产品;表达载体pProEX HTb、凝胶DNA纯化Kit，Pfx DNA扩增Kit为Gibco公司产品;RNase A购自华美公司;Western Blot Kit为Boehringer Mannheim公司产品;硝酸纤维素滤膜为美国Schlcher&&Schuell公司产品;HRP标记羊抗鼠Ig抗体为kako公司产品;鼠抗His6 mAb No.1抗体为第四军医大学基础部免疫学教研室张新海博士惠赠.其余试剂为国产分析纯或分子生物学专用试剂.E.coli DH5α由本实验室保存.
1.2 方法
1.2.1 Der p2基因片段的设计、合成及序列测定 将全长387bp的Der p2基因分成11个片段（Fig1），F1和R1为Der p2基因的引物，含有BamHI和HindIII位点;F3，F5，R4，R6为大片段;R3，R5，F4，F6为小片段，5’端磷酸化，分别与F3，F5，R4，R6互补;R2为连接F1与F3间的补丁;R7为连接R6与R1间的补丁;在片段3和4以及片段5和6之间设计成4个碱基互补的粘端，在（1～2）和（3～4）、（3～4）和（5～6）之间设计有SmaI和ClaI位点作为片段间连接之用.各单链基因片段由北京赛百盛公司合成.DNA序列由上海基康公司测定.
图1 略
1.2.2 Der p2基因的连接 设立5个体系分别以R2，F3，R4，F5，R6为模板，以F1，R3，F4，R5，F6为引物行片段（1～2），3，4，5和6的单链扩增:在50μL反应体系中，加入10×PCR缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶1μL（83nkat），dNTP5μL（2.5mmol・L-1 ），大、小片段各1μL（10μmol・L-1 ），混匀，置94℃变性30s后，进行循环反应.参数为:94℃30s，58℃30s，72℃20s，共15个循环，末次循环结束后72℃保温30min.PCR产物用30g・L-1 琼脂糖凝胶电泳观察，回收DNA条带，按说明用Gibco公司的凝胶DNA纯化试剂盒纯化扩增产物.按Fig2所示流程，片段3和4，5和6分别用T4DNA连接酶催化，于4℃连接过夜，将连接产物（3～4），（5～6）与pGEM-T-easy载体片段、（1～2）与pMDT18载体按3∶1的浓度比例，在T4DNA连接酶催化下，于室温连接2h，转化用低温CaCl2 制备的E.coli DH5α感受态细胞，涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg・L-1 ），经IPTG诱导，通过X-gal显色筛选白色菌斑.
随机挑选6个白色菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB中，37℃振荡培养过夜，参照文献［3］以碱裂解法小量提取质粒DNA，经酶切及序列测定鉴定阳性克隆.选择序列正确的克隆按Fig2先用SmaI和EcoRI将片段（3～4）切出，克隆入相同酶消化的（1～2）-pMD18-T中，鉴定为阳性克隆后，再用ClaI和EcoRI消化，与相同酶切出的片段（5～6）连接，鉴定阳性克隆.
1.2.3 Der p2基因的克隆 以（1～6）-pMD18-T为模板，用Gibco公司的Pfx DNA聚合酶按说明进行扩增，置94℃变性30s后，进行循环反应.参数为:94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30个循环，末次循环结束后72℃保温10min.经15g・L-1 琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，再作为模板，用F1和R1为引物在50μL反应体系中扩增，产物经电泳回收、纯化后用BamHI和HindIII消化，克隆入经相同酶消化的pProEX HTb中，即Der p2-pEX.挑取克隆经PCR和酶切鉴定后行序列测定.
图2 略
1.2.4 Der p2基因在大肠杆菌中的初步表达 将含重组表达质粒Der p2-pEX的单个菌落接种于含氨苄青霉素（100mg・L-1 ）的LB培养液中，37℃振荡培养过夜.次日将1%菌液转种于2mL LB培养基中，37℃振摇至A600nm =0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1～2mmol・L-1 ，37℃诱导3～5h.取1mL诱导表达菌液离心，回收菌体沉淀，以2×凝胶加样缓冲液50μL悬浮，煮沸5min，离心后取20μL上清在Bio-Rad电泳仪上同时进行两块150g・L-1 SDS-PAGE，一块用于考马斯亮蓝染色，另一块行Western-blot分析.
1.2.5 Western-blot分析 参照文献［4］的方法进行电泳和转膜，所用滤膜为0.45μm孔径的硝酸纤维素滤膜，50g・L-1 脱脂奶封闭后，加入1∶5000稀释的抗His6 mAb，4℃过夜，1g・L-1 Tween PBS洗涤后，加入HRP标记羊抗鼠Ig抗体，室温放置1h，按说明用Boehringer Mannheim公司的Western-Blot Kit进行检测，Kodak公司胶片曝光20s～2min.
图3 略
2 结果
2.1 Der p2基因的连接 通过单链扩增得到双链的片段（1～2），3，4，5和6，电泳证实各片段大小正确（Fig3）.片段（1～2）克隆入pMD18-T中，片段3和4，5和6分别连接后克隆入pGEM-T-easy载体，挑取白色菌落抽提质粒，阳性克隆测序证实（1～2），（3～4），（5～6）序列正确（Fig4）.从（3～4）-pGEM-T-easy中切出片段（3～4）克隆入（1～2）-pMD18-T中得到（1～4）-pMD18-T，再从（5～6）-pGEM-T-easy中切出片段（5～6）克隆入（1～4）-pMD18-T中得到（1～6）-pMD18-T.
2.2 Der p2基因的克隆 以（1～6）-pMD18-T为 模板，F1和R7为引物，扩增得到约398bp的条带;再以此条带为模板，F1和R1为引物，扩增得到约407bp的条带，为两端带有BamHI和HindIII的Der p2cDNA，克隆入（1～2）-pMD18-T中得到Der p2-pMD18-T，BamHI和HindIII双酶消化可得到约400bp的DNA片段（Fig5），经测序证实所构建的基因序列完全正确，与GenBank数据库所收录的Der p2基因的符合率为97.4%，推导的氨基酸序列的符合率为100%（Fig6）.
图5 －图6 略
2.3 Der p2基因在大肠杆菌中的初步表达 利用BamHI和HindIII将Der p2cDNA克隆入表达载体pProEX HTb中，酶切证实后，含重组质粒Der p2-pEX的菌液于37℃用2mmol・L-1 IPTG诱导5h，150g・L-1 SDS-PAGE，同时行Western-blot分析显示，在Mr 为17×103 左右有一条新的蛋白带，而诱导的空载体菌则无此带.通过扫描分析，该蛋白约占总蛋白量的20%（Fig7）.
3 讨论
屋尘螨过敏被认为是过敏性哮喘、鼻炎和特应性皮炎的主要原因，在屋尘螨抗原浸液中含有多种蛋白成分，其中Der p2是屋尘螨抗原中的重要成分，70%～90%的螨过敏者Der p2特异性IgE阳性［5］ .许多儿童在较早年龄即接触屋尘螨抗原，大约30%形成Th3 样免疫反应，表现为对屋尘螨抗原特异性IgE升高和皮肤试验阳性［1］ .
图7 略
现今已知，Der p2含有129个氨基酸，Mr 约14×103 ，在屋尘螨蛋白浸液中的含量约5～50mg・L-1 .不同尘螨Der p2抗原含量不同，且氨基酸序列也有所不同，如粉尘螨的Der f2与屋尘螨Der p2在核苷酸和氨基酸水平的同源性为86.8%和88.4%［6］ ;由于从环境中捕获的尘螨种类繁多，且屋尘螨体内的Der p2基因具有多态性［7-9］ ，因而获得正确的屋尘螨Der p2基因较为困难.本研究采用基因分段合成连接的方法，构建了完整的Der p2基因，与GenBank数据库中Der p2基因比较，碱基符合率为97.4%.其中发生突变的碱基并非PCR造成的，而是为方便基因连接和在BCG中表达而设计的，这些基因的突变并未造成编码的氨基酸改变.菌体蛋白电泳及Western-blot分析显示该基因可成功在大肠杆菌E.coli中表达，且该蛋白含量约占总蛋白量的20%.
由于超过80%的哮喘儿童对尘螨过敏，因而这些过敏原成为哮喘的主要原因.现已明确，Der p2的1～56，45～67，94～104，117～143，103～143，107～119，110～119，110～131表位为人类T细胞所识别［10-13］ ，应用人工合成上述的肽段作为免疫封 闭物质，成功封闭了IgE，并可调节特异性T细胞处于不应答状态.在此基础上，提出“利用抗原肽基因重组BCG疫苗防治哮喘等过敏性疾病”的设想.屋尘螨抗原Der p2基因的成功克隆及在E.coli中的初步表达，为开展更深入的研究奠定了基础.
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