【关键词】 哮喘
关键词: 哮喘;嗜酸粒细胞;嗜酸粒细胞趋化因子;嗜酸粒细胞阳离子蛋白
摘 要:目的 探讨哮喘发病中嗜酸粒细胞趋化因子（Eotax-in）基因表达与嗜酸粒细胞（Eos）活化的关系及糖皮质激素的作用. 方法 将豚鼠30只随机分为哮喘组、地塞米松治疗组及正常对照组.卵蛋白致敏及诱发哮喘;制备豚鼠肺组织病理标本，HE染色;免疫组织化学技术观察Eos阳离子蛋白（ECP）在哮喘气道粘膜中的表达;原位分子杂交方法观察肺组织中Eotaxin mRNA的表达;将二者行相关性分析. 结果 与地塞米松治疗组、正常对照组相比较，哮喘组豚鼠肺组织中ECP细胞（172±44）・mm-2 与eotaxin mRNA（196±57）・mm-2 表达明显增强（P&<0.001），Eos活化增多;且二者呈正相关性（r=0.7447，P=0.0135）;糖皮质激素对Eotaxin mRNA（20±14）・mm-2 ，ECP（26±19）・mm-2 表达有显著的抑制作用. 结论 哮喘豚鼠肺组织中Eotaxin表达增强，Eos活化增多.糖皮质激素能抑制Eotaxin表达及Eos活化.
Keywords:asthma;eosinophil;eotaxin;eosinophil cation protein
Abstract:AIM To study the relationship between gene ex-pression of eotaxin and eosinophils activating in lung tissue of asthmatic guinea pigs，and to study the essential function of corticosteroid in them.METHODS Thirty guinea pigs were pided into three groups（asthma，dexamethasone，nomal control）.Ovalbumin（Ova）sensitized and challenged guinea pigs were used as the model of asthma.The pathologic sam-ples of lung tissue were stained with HE;the expression of ECP in asthmatic airway mucosa was observed by immuno-histochemistry（IHC），and the expression of eotaxin mRNA in guinea lung tissue was detected by in situ hybridization（ISH）.The results were analysized by linear correlation.RESULTS Compared with the dexamethasone and normal control groups，ECP cells（172±44）・mm-2 and eotaxin mRNA（196±57）・mm-2 were expressed at high levels in lung tissue of asthmatic guinea pig，and the activated eosinophils increased（P&<0.001）.The expression of eotaxin mRNA positively correlated with the expression of ECP（r=0.7447，P=0.0135）.Glucocorticoids prominently inhibited the expression of eotaxin mRNA（20±14）・mm-2 and ECP（26±19）・mm-2 .CONCLUSION The expression of eotax-in gene and the activated eosinophils increased in lung tissue of asthmatic guinea pigs，while glucocorticoids could promi-nently down-regulate the expression of eotaxin gene and in-hibit eosinophils activation.
0 引言
哮喘的特征表现为嗜酸粒细胞（Eos）在支气管粘膜组织中的浸润［1-3］ .Eos在活化状态下脱颗粒，释放活性蛋白，其中最主要的是Eos阳离子蛋白（ECP）.Eotaxin是一种β亚族趋化因子，是从抗原诱发哮喘豚鼠肺泡灌洗液中鉴定出的一种Eos趋化物，被命名为Eos趋化因子，对Eos具有特异性的趋化作用，在哮喘的发病过程中能选择性地诱导和趋化Eos在肺组织中的募集［4，5］ .我们观察哮喘豚鼠肺组织中Eotaxin基因与ECP阳性表达，探讨哮喘发病中Eotaxin基因表达与Eos活化的关系及其对Eos选择性的趋化作用.
1 材料和方法
1.1 材料 健康豚鼠30只，由第一军医大学实验动物中心提供.雌雄不拘，体质量250～350g，随机分为①哮喘模型组（n=10）;②地塞米松（DXM）治疗组（n=10）;③正常对照组（n=10）.卵蛋白（Ova）:Sigma公司;ECP mAb EG2:Pharmacia公司;SABC免疫组化试剂盒:武汉Boster公司;Eotaxin寡核苷酸探针序列:5′CAG TCG CTG AAA GGA GAT CTT CTT ATT GGT CAC ACG AAA GCA GCA GGC AC3′，根据Genebank中登录的Eotaxin（Accession U18941），由Oligo5软件设计，大连TaKaRa公司合成并在5′末端用地高辛标记;敏感性加强型原位杂交检测试剂盒II:武汉Boster公司;图像分析仪:Photodetecter ARGUS50型，滨松Pho-tonix公司.
1.2 方法
1.2.1 建立哮喘动物模型 将哮喘组、DXM治疗组豚鼠腹腔内均注入100g・L-1 Ova1mL，致敏，制备豚鼠哮喘动物模型，对照组腹腔内注入等量生理盐水.哮喘组致敏后14d，吸入雾化的10g・L-1 Ova诱喘，1次・d-1 ，连续5d.DXM治疗组每次诱发前2h腹腔内注入地塞米松0.5mg・kg
-1 ，余同哮喘组.对照组豚鼠每日给予生理盐水雾化吸入1次，吸入时间为同批哮喘组诱喘的最长时间.实验豚鼠给予3.5mL・kg-1 水合氯醛腹腔麻醉后，剖开胸腔，切开左心房，将穿刺针刺入右心室及肺动脉干，固定后快速滴入4℃生理盐水100mL冲洗干净血液，取40g・L-1 多聚甲醛500mL，快速滴注100mL，剩余液体缓慢滴注至肺组织完全变白为止.取出肺组织，用灭菌手术刀将肺组织按与气道横断面垂直方向修剪成1～2mm厚度的组织片，放置于4℃的40g・L-1 多聚甲醛中继续固定12～24h后，进行脱水、透明、包埋、切片及HE染色.
1.2.2 检测ECP阳性表达 免疫组织化学参照武汉Boster公司SABC免疫组化试剂盒说明书.切片脱蜡至水，以30mL・L-1 h3 O2 ，室温处理5～10min，双蒸水洗3次×2min，滴加复合消化液5～10min，双蒸水洗3次×2min，滴加正常血清封闭液，室温处理5～10min，甩去多余液体，不洗，滴加1∶200小鼠抗EG，24℃24h，阴性对照以PBS替代mAb，0.01mol・L-1 PBS洗2min×3次，滴加生物素化山羊抗小鼠/兔IgG，20～37℃20/30min，0.01mol・L-1 PBS洗2min×3次，滴加试剂SABC，20～37℃20/30min，0.01mol・L-1 PBS洗5min×4次，DAB显色，室温，镜下控制时间，0.01mol・L-1 PBS洗5min×4次，苏木素复染1min，脱水，透明，封片，镜检，计算机图像分析测量单位面积内ECP阳性细胞数.
1.2.3 检测Eotaxin基因阳性表达 原位分子杂交参照武汉Boster公司敏感性加强型原位杂交检测试剂盒II说明书.灌注后的肺组织及时予以固定.固定液为40g・L-1 多聚甲醛/0.1mol・L-1 PBS，含有1mL・L-1 DEPC.标本较大时用刀片切开.固定不超过24h.常规脱水、浸蜡、包埋.切片厚度5～7μm.采用多聚赖氨酸或APES与多聚赖氨酸处理玻片.石蜡切片经常规脱蜡至水.30mL・L-1 h3 O2 室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶.切片上滴加30mL・L-1 柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（30mL・L-1 柠檬酸1mL加两滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化5～30min，暴露mRNA核酸片段.0.5mol・L-1 TBS洗5min×3次.蒸馏水洗1次.预杂交:每张切片加20μL预杂交液，恒温箱37～40℃预杂交2h.不洗.杂交:按每张切片加20μL含地高辛标记探针的原位杂交液.将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上.恒温水浴箱37～40℃杂交过夜.杂交后洗涤:揭掉盖玻片，30～37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×3次;30～37℃左右水温的0.2×SSC洗涤10min×1次.滴加封闭液:室温20min，不洗.滴加兔抗地高辛:37℃60min.0.5mol・L-1 TBS洗2min×3次.滴加生物素化羊抗兔IgG:37℃30min.0.5mol・L-1 TBS洗2min×3次.滴加SABC-AP:37℃30min.0.5mol・L-1 TBS洗5min×4次.DAB显色，苏木素复染，水性封片剂封片.计算机图像分析测量单位面积内Eotaxin阳性细胞数.
统计学处理:采用SPSS8.0统计软件行t检验和方差分析.两因素之间的相关性分析，采用直线相关分析.P&<0.05为显著性差异.
2 结果
2.1 哮喘豚鼠气道的组织病理学 哮喘组气道粘膜水肿明显，表现为粘膜上皮细胞肿胀，核被挤压至细胞边缘，部分上皮细胞呈空泡样变性、坏死、脱失，杯状细胞增多.支气管管腔缩小，甚至完全闭塞，部分可见粘液栓.气道周围血管扩张充血，气道粘膜层、粘膜下层及血管周围组织有大量的炎症细胞浸润，主要以Eos、单核细胞及淋巴细胞为主，粘膜基底层增厚.正常对照组气道粘膜无明显水肿，支气管管腔光滑，无闭塞，气道及血管周围未见炎症细胞浸润.DXM治疗组有轻度炎症变化，较哮喘组明显减轻（Fig1～4）.
2.2 ECP阳性细胞 哮喘组可见细支气管粘膜下层、肌层有大量的棕黄色颗粒围绕水肿闭塞的气道管腔，呈环形排列.肺小血管及肺泡周围组织可见较多的胞质呈棕黄色的EG2+ 阳性细胞.DXM治疗组及正常对照组细支气管管腔光滑，粘膜下及肌层未见棕黄色阳性颗粒分布.肺小血管及肺泡周围组织偶可见阳性细胞（Fig5～7）.计算机图像分析结果显示EG2+ 细胞数・mm-2 （x ±s）:哮喘组（172±44），地塞米松组（26±19），正常对照组（13±7）.哮喘组与地塞米松组、正常对照组相比较有显著性差异（P&<0.001），地塞米松组与正常对照组之间无明显统计学意义（P=0.0688）.
图1 －图9 略
2.3 Eotaxin mRNA在肺组织中的表达 哮喘组在支气管粘膜层、粘膜下层及血管周围组织可见大量的呈棕黄色的阳性细胞，高倍镜下胞质内有棕黄色的阳性颗粒，提示哮喘豚鼠气道粘膜组织中有大量的Eo-taxin mRNA表达.DXM组Eotaxin mRNA表达阳性细胞较少，粘膜层未见明显的阳性细胞，粘膜下及周围组织可见少量的阳性细胞.正常对照组未见明显的阳性细胞（Fig8，9）.计算机图像分析结果显示Eotaxin阳性细胞数・mm-2 （x ±s）:哮喘组（196±57），地塞米松组（20±14），正常对照组（11±6）.哮喘组与地塞米松组、正常对照组相比较有显著性差异（P&<0.001），地塞米松组与正常对照组之间无明显统计学意义（P=0.0898）.ECP，Eotaxin二者在肺组织中阳性表达呈正相关（P=0.0135，r=0.7447）.
Eotaxin是一种Eos选择性的化学趋化剂，属于β亚族趋化因子，对Eos具有特异性的趋化作用［6，7］ ，我们采用原位分子杂交技术在mRNA水平上从组织形态学角度观察了Eotaxin在支气管肺组织中的表达情况，发现哮喘组Eotaxin mRNA表达增强，阳性细胞主要分布于气道粘膜上皮层、粘膜下层以及肺间质血管周围组织，说明在Ova致敏诱发哮喘后，可刺激气道上皮细胞、血管内皮细胞、粘膜下成纤维细胞及炎症细胞进行Eotaxin mRNA的转录及蛋白质的表达.原位杂交结果经图像分析系统阳性细胞计数定量分析后，发现哮喘组与DXM组及对照组之间存在显著的统计学差异.后两组的Eotaxin mRNA表达明显低于哮喘组.以Eos为主的炎性细胞浸润是哮喘气道慢性炎症的主要特征，它具有炎性损伤作用，是一种重要的炎症效应细胞.Eos可释放多种活性物质参与变应性炎症的调节，Eos在活化状态下，脱颗粒，释放活性蛋白，主要为MBP，ECP，EPO和EDN4种，其中ECP的分泌是Eos被激活的标志［8，9］ .EG2可与分泌型ECP特异性结合，因此应用EG2免疫染色，可以更直接证实活化的Eos在气道炎症反应中的表达，比总Eos计数更能反映哮喘的严重程度和动态评价病情.本结果显示哮喘组小支气管粘膜下、肌层可见大量的EG2阳性颗粒，并围绕水肿闭塞支气管管腔呈环形排列，肺小血管及肺泡周围组织也可见较多的胞质呈棕黄色的阳性细胞.与正常对照组及地塞米松治疗组比较具有显著差异.
通过图像分析仪对ECP免疫组化及Eotaxin原位杂交结果进行阳性细胞计数定量分析，统计学结果显示:ECP（EG2+ ）阳性细胞与Eotaxin mRNA阳性细胞（r=0.7447，P=0.0135）二者之间存在显著的正线性相关关系.ECP是活化的Eos分泌的主要炎性蛋白，EG2是ECP的mAb，通过对EG2阳性细胞的免疫染色观察，可以直接证实Eos在气道炎症反应中的表达［10］ .对同一组织标本分别行ECP免疫组化及Eotaxin原位杂交，并对结果进行线性相关分析，可以看出二者有显著正线性相关关系，说明在哮喘豚鼠肺组织中Eotaxin表达增强，Eos活化增多.
从本结果还可以看出地塞米松处理组哮喘发作较为 轻微，其组织病理学改变明显不同于哮喘组，气道炎症反应不严重，同正常对照组差别不大.肺组织中ECP，Eotaxin阳性表达均明显低于哮喘组，并与正常对照组相近.说明地塞米松抑制了Eos的表达及活化;抑制了各种结构性细胞及炎症细胞产生Eotaxin［11，12］ .
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