作者：李树钧 王华 戚好文 张健 何鹏 张文红 季少平 刘新平 药立波
【关键词】 细胞转染
关键词: ndr2基因;细胞转染;表达
摘 要:目的 构建蜕皮素诱导的抑癌基因ndr2哺乳动物真核表达载体（pIND-ndr2），转染肺腺癌细胞GLC-82，观察ndr2基因表达，为进一步研究ndr2的生物学功能打下基础. 方法 以RT-PCR方法确定正常人肺组织和肺腺癌GLC-82细胞ndr2的表达高低.PCR方法扩增ndr2，以BamHI+EcoRI双酶切连接入pUC19载体中，测序正确后，插入到蜕皮素诱导的真核表达载体pIND中.连有ndr2基因的载体（pIND-ndr2）用脂质体方法转染到培养的肺腺癌细胞GLC-82中.经G418和zeocin双抗生素筛选后，挑取单克隆进行培养，用蜕皮素诱导ndr2表达，用RT-PCR，western印迹和免疫组织化学方法验证获得表达的细胞株. 结果 PCR的方法扩增获得大小约1200bp的片段，连接入预先插入HA-tag的pUC19载体的ndr2基因经HindⅢ+EcoRI酶切后，构建到真核表达载体pIND中，酶切鉴定后证明连接片段正确.通过双载体转染和双抗生素筛选后，培养的细胞经诱导后检测到实验组ndr2的高表达，而对照组和未诱导的实验组ndr2表达均较低. 结论 ndr2基因成功转染培养的肺腺癌GLC-82细胞，建立了ndr2的可诱导表达的细胞系.
Keywords:ndr2gene;cell transfection;expression
Abstract:AIM To Construction a recombinant pIND-ndr2expression vector，to observe its steady expression in trans-fected human lung adenocarcinoma cell line GLC-82and its role in further study of biological function of ndr2for lung adenocarcinoma.METHODS ndr2gene of human normal lung tissue and human lung adenocarcinoma cell line GLC-82was amplified by PCR-RT.PCR amplification was performed by using primers based on the known gene sequence of ndr2，and fragments of DNA was cloned into vector pUC19.The sequence of the fusion gene was analyzed.Ecdysone-inducible mammalian expression system was used.A recombinant pIND-ndr2vector was constructed at its HindⅢ+EcoRI sites.The recombinant pIND-ndr2vector and pIND vector were tranfected into GLC-82cells respectively，and the cell clones were screened with G418and zeocin.Expression of ndr2gene was detected by RT-PCR，and expression of ndr2protein was detected by western blot and immunohis-tochemical method after the cells were induced with ponas-terone A.RESULTS The sequence of ndr2gene that was cloned into vector pUC19was correct.ndr2gene was cor-rectly transfected into GLC-82cells and was appropriately expressed with induction of panosterone A.The expression of ndr2of lung adenocarcinoma cell GLC-82transfected by pIND-ndr2with induction of panosterone A was high.CONCLUSION Recombinant pIND-ndr2expression vector was successfully constructed and expressed steadily in human lung adenocarcinoma cell line GLC-82.
0 引言
ndr2基因是1999年从正常人全脑cDNA文库中克隆到的新基因［GenBank登录号AF-159092.］［1］ ，染色体定位于14q12.1，基因组中由15个内含子，16个外显子构成.ndr2的cDNA全长2024bp.编码357个氨基酸的蛋白质，Mr 约41×103 .目前研究表明，ndr2基因多种肿瘤组织或细胞系如肺癌、结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮腺癌中无表达或低表达，相反在上述肿瘤相应的正常组织细胞中有较高水平的表达.另外在中枢神经系统的大脑皮质、白质、神经核，唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中高表达.同时基因转染实验表明，ndr2可抑制胶质瘤BT325细胞由G1期向S期的过渡，因此，推测ndr2可能是一种新的抑癌基因.基因转染是研究基因功能的重要方法［2］ .蜕皮素诱导的哺乳动物稳定转染系统是通过双载体转染，只有在蜕皮素诱导后才能使转染基因得到表达，从而能够控制转染基因的表达.现利用蜕皮素诱导的哺乳动物真核表达载体，建立ndr2基因转染肺腺癌GLC-82细胞，为进一步研究ndr2在肺腺癌中的生物学特性奠定了基础.
1 材料和方法
1.1 材料 肺腺癌GLC-82细胞株由本校西京医院检验科临床分子生物学实验室提供.各种限制性内切酶和G418购自华美生物工程公司.PCR反应系统（Taq DNA聚合酶、dNTP，10×PCR缓冲液）、RNA酶抑制剂购自宝泰克公司，哺乳动物真核表达载体（pIND载体、pV载体）、蜕皮素panosterone A和抗生素zeocin购自Invitrogen公司，RPMI1640培养基和Trizol购自Gibco公司，反转录酶AMV购自Promega公司.
1.2 方法
1.2.1 引物设计 设计的引物序列为:5′CG GGA TCC ATG GCG GAG CTG CAG GAG GTG3′，5′CG GAA TTC AAC AAG GGC CAT TCA ACA GGA GAC3′;其中5′端引物引入BamHI的酶切位点，3′端引物引入EcoRI的酶切位点.
1.2.2 目的基因片段的扩增与克隆 常规方法做PCR扩增，以人脑cDNA为模板，94℃预变性30s后，加入Taq DNA聚合酶66.7nkat.按94℃5s，72℃4min进行5个循环，94℃5s，70℃4min进行5个循环，94℃5s，68℃4min进行25个循环，另加72℃120s延伸.产物经胶回收后，以BamHI+EcoR I双酶切目的片段后定向插入预先插入HA-tag的pUC19载体中.重组后的质粒经转化扩增后，以BamHI+EcoRI双酶切鉴定，若有与预期基因片段大小相近的片段切下则为阳性.基因序列测定由上海基康公司进行.
1.2.3 真核表达载体pIND的构建与转染 将测序后的载体pUC19-ndr2以HindⅢ+EcoRI消化，切下的片段插入到蜕皮素诱导表达pIND空载体中，转化感受态细胞JM109，摇菌后用上海华舜质粒提取试剂盒提取质粒，以HindⅢ+EcoRI酶切鉴定.将 人肺腺癌GLC-82细胞接种于RPMI1640培养基（含100mL・L-1 的胎牛血清），于37℃，50mL・L-1 的CO2 条件下培养.将酶切鉴定正确的重组载体pIND-ndr2，pV和脂质体lipofectin共转染培养的肺腺癌GLC-82细胞.以空载体（pIND）、pV和脂质体转染做对照.
1.2.4 细胞株的筛选 转染后48h，换RPMI1640培养基（含100mL・L-1 的胎牛血清），同时加入G418（终浓度500mg・L-1 ）和zeocin（终浓度500mg・L-1 ）进行筛选.2wk后挑取单个集落进行传代培养.
1.2.5 RT-PCR筛选表达ndr2的细胞株 经上述的抗生素筛选后，挑选单克隆并扩大培养.分别收集蜕皮素诱导72h和未诱导的ndr2转染GLC-82细胞及空载体转染细胞.加入1mL Trizol，冰浴条件下用注射器反复吹打，液体倒入1.5mL试管中，加入0.2mL氯仿，静置15min，4℃离心，12000g，15min，取上清加入0.5mL异丙醇，静置20min，4℃离心，12000g，10min.沉淀重悬于75mL・L-1 乙醇，4℃离心7500g，5min，将其溶于DEPC处理水中，紫外分光光度计定量.取1μg模板加入1μL oli-go dT，70℃，5min，迅速置于冰中，加入AMV5×buffer5μL，10mmol・L-1 dNTP1μL，RNA酶抑制剂1μL，AMV RT反转录酶1μL，加DEPC处理水至25μL，42℃60min.即得cDNA.PCR鉴定ndr2基因的表达，条件为94℃预变性30s后，加入Taq DNA聚合酶66.7nkat.按94℃5s，72℃4min进行5个循环，94℃5s，70℃4min进行5个循环，94℃5s，68℃4min进行25个循环，另加72℃7min延伸.
1.2.6 Western blot鉴定表达ndr2的细胞株 培养ndr2转染肺腺癌GLC-82细胞及空载体转染细胞，经过15μL蜕皮素（1mmol・L-1 ）诱导72h，收集细胞约1×107 ，加入0.2mL的NP-40细胞裂解液（含10g・L-1 NP-40，20mmol・L-1 Tris-Cl，pH8.0，150mmol・L-1 NaCl，0.2g・L
-1 NaN3 ，100mmol・L-1 CaCl2 ，用前加入1.0mmol・L-1 PMSF）.离心（14000g，4℃，10min），取上清常规方法做SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，加入ndr2单抗，孵育后，洗涤.按检测试剂盒ECL（为Amer-sham公司的化学发光试剂）的说明进行，于暗室条件下压X-光片，感光10min.
1.2.7 免疫组织化学鉴定ndr2细胞内转染 培养ndr2转染肺腺癌GLC-82细胞及空载体转染细胞，经过15μL蜕皮素（1mmoL・L-1 ）诱导72h，将所培养的细胞胰酶消化，加入盖玻片上孵育24h，PBS洗3次，用40g・L-1 的多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，37℃4h晾干，100mL・L-1 双氧水封闭30min，蒸馏水洗3次，3mL・L-1 Triton X-100打孔15min，PBS洗3次，正常羊血清封闭30min，加入ndr2鼠单抗，4℃过夜，PBS洗3次，每次10min，加入抗鼠二抗，60min，PBS洗3次，加入SABC，30min，PBS洗4次，DAB显色.
2 结果
2.1 含ndr2基因的pUC19重组质粒酶切鉴定 以PCR方法获得的ndr2基因经BamHI+EcoRI双酶切后，连接入预先插入的HA-tag的pUC19载体，命名为pUC19-ndr2.重组质粒再经BamHI+EcoRI双酶切后，得到大小约1200bp的酶切片段（Fig1）.基因序列测定正确.获得的阳性克隆经测序证明所插入的序列正确.
图1 略
2.2 真核表达载体的酶切鉴定 pUC19-ndr2载体经HindⅢ+EcoRI双酶切后，再把切出的含有HA-tag的ndr2基因克隆进pIND载体中，该质粒命名为pIND-ndr2.获得的重组质粒再经HindⅢ+EcoRI双酶切后，可以得到大小约1400bp的酶切片段，证实连接正确（Fig2）.
图2 略
2.3 ndr2基因转染后表达鉴定 ndr2基因转染肺腺癌GLC-82细胞、空载体转染肺腺癌GLC-82细胞，经蜕皮素诱导72h，检测到转染ndr2基因的肺腺癌GLC-82细胞在蜕皮素诱导72h后的ndr2转录得到加强，与空载体转染的细胞之间存在明显差异.而未经蜕皮素诱导的pIND-ndr2转染肺腺癌细胞GLC-82和空载体转染细胞ndr2基因的表达均较低（Fig3）.
2.4 转染ndr2基因的细胞中ndr2蛋白的表达增强 培养pIND-ndr2转染的肺腺癌GLC-82细胞及空载体转染肺腺癌GLC-82细胞，经蜕皮素诱导72h，Western blot结果显示，与空载体转染的细胞相比，经蜕皮素诱导的肺腺癌GLC-82细胞中的ndr2蛋白表达明显增强（Fig4）.
图4 略
2.5 免疫组织化学鉴定转染细胞内ndr2蛋白的表达 pIND-ndr2转染的肺腺癌GLC-82细胞在蜕皮素诱导72h，经免疫组织化学SABC方法检测，发现在pIND-ndr2转染的肺腺癌GLC-82细胞胞质内有ndr2的阳性表达，而在pIND空载体转染的肺腺癌GLC-82细胞有很弱的ndr2的表达（Fig5）.
图5 略
3 讨论
蜕皮素诱导的哺乳动物真核表达载体，可控制性强，也是一个双载体转染系统，把所要转染的基因连入pIND空载体中，和另一载体pV同时转染入细胞内，经过双药筛选，挑选出单个细胞克隆进行培养，经过蜕皮素诱导后转入细胞内的基因得以表达，而未经蜕皮素诱导转入细胞内的基因不表达，从而为深入研究转入细胞内的基因奠定基础.关于基因表达的检测方法有多种，可以从mRNA和蛋白质两个水平上检测基因的表达情况，并可相互印证.从mRNA水平检测的方法有:点杂交、Northen杂交、反转录PCR，原位PCR和原位杂交等;从蛋白质水平检测的主要方法有:免疫印迹法（Western blot）和免疫组化染色等.本实验从多个方面证实转染基因成功在细胞内表达.
肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤.肺癌发生过程是一个多因素、多阶段复杂的分子生物学过程，涉及癌基因与抑癌基因的改变.其中对基因改变的研究也日益深入，例如发现p53是人类肿瘤中包括肺癌再内突变频率最高的抑癌基因.
p53蛋白能下调细胞周期磷酸酶，调节细胞从G2期 到有丝分裂期［3］ .当细胞受到损伤时，p53积聚并激活下游基因，其蛋白产物p21抑制CDK及DNA聚合酶活性，使细胞周期阻滞在G1/S期，从而使损伤的DNA得到得到修复或诱导细胞凋亡［4］ .研究表明，在N-myc缺失突变的小鼠胚胎，ndr1的表达上调.在胚胎发育的特定阶段，当N-myc的表达下降时，ndr1开始表达，表明ndr1的表达受到N-myc的抑制［5］ ;ndr1的表达也受到p53基因的调节，这些线索均提示ndr可能为抑癌基因.人源的ndr基因家族已克隆有四个成员:ndr1，ndr2，ndr3和ndr4，同源性约55%［6］ .在此之前的研究表明，ndr2在部分肿瘤组织中呈低表达或不表达.因此推测ndr2可能与肿瘤的发生有关系.基因转染是研究基因功能的重要方法［7］ .在NSCLC患者进行了腺病毒载体转染野生型p53基因的临床实验［8］ ，结果提示p53基因可以通过诱导细胞凋亡而杀灭肿瘤细胞［9］ .用反义K-ras片段的重组腺病毒感染多种K-ras突变的肺癌细胞株，发现K-ras蛋白表达降低，单层细胞生长和菌落形成受到抑制［10］ .
本文研究表明，ndr2基因成功在肺腺癌GLC-82细胞中转染和表达，通过蜕皮素诱导的哺乳动物双载体稳定转染系统，在蜕皮素诱导下使所转入基因进行表达，而且对细胞的生长状态影响不大.此转染细胞系的建立，为进一步研究ndr2对肺腺癌GLC-82细胞生长、增殖等影响和观察转染基因对细胞生物学功能的影响奠定了基础.
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