作者：于化鹏 戚好文 陈新 王钧 邓火金 刘玉华
【关键词】 ，哮喘
关键词: 哮喘;嗜酸粒细胞;嗜酸粒细胞趋化因子
摘 要:目的 探讨过敏性哮喘中嗜酸粒细胞趋化因子Eo-taxin致气道炎症的机制. 方法 将豚鼠40只随机分为哮喘组和对照组，卵蛋白致敏及诱发过敏性哮喘.①收集支气管肺泡灌洗液（BALF），观察细胞总数（TC）及嗜酸粒细胞（Eos）、巨噬细胞（AM）、淋巴细胞（L）、中性粒细胞（N）比例变化;②豚鼠肺组织病理标本经HE染色，观察病理学改变;③采用原位分子杂交技术观察肺组织中Eotaxin mRNA的表达;④采用Northern blot方法观察肺组织中Eotaxin mRNA表达情况. 结果 过敏性哮喘豚鼠BALF中TC，Eos比例较对照组明显升高（P&<0.01），AM比例显著下降（P&<0.01），L和N比例与对照组相差不明显（P&>0.05）.哮喘豚鼠肺组织中可见气道炎症反应及Eos和L粘膜下浸润.支气管粘膜、粘膜下层及周围肺组织中Eotaxin mRNA阳性细胞表达率（198±46）mm-2 较对照组（16±8）mm-2 明显增加（P&<0.01）.Nortthern blot杂交可见哮喘组表达Eotaxin mRNA较对照组明显升高. 结论 过敏性哮喘中Eotaxin基因表达明显增强，同时伴有Eos肺内募集及激活，进而导致气道炎症而诱发哮喘.
Keywords:asthma;eosinophil;eotaxin
Abstract:AIM To study the role of eotaxin in the airway inflammation of asthma.METHODS ①Ovalbumin（Ova）sensitized and challenged guinea pigs;②Bronchial alveolar lavage fluid（BALF）of guinea pigs were collected，and the cells were classified and counted;③The pathologic samples of lung tissue were stained with HE;④The expression of eotaxin mRNA in lung tissue of guinea pigs was examined by in situ hybridization（ISH）and Northern blot.RESULTS In airway allergic inflammation，the infiltration of eosinophils was the predominant pathologic change of asthma;The counts of eosinophils enhanced more prominently in BALF of asthmatic guinea pigs than in that of the normal control group（P&<0.01）.Compared with the normal subjects，the epithe-lium of bronchial mucosa and alveolus were severely injured;Eotaxin mRNA was expressed at higher levels in lung tissues of asthmatic guinea pigs（198±46）cells・mm-2 than in those of the normal guinea pigs（16±8）cells・mm-2 （P&<0.01）by ISH and the same result also can be found by Northern blot.CONCLUSION Bronchial asthma is a disease which is char-acterised by airway allergic inflammation and infiltratration of eosinophils.Eotaxin gene is expressed at high levels in asth-matic lung tissues，which can selectively accumulate and acti-vate eosinophils.We believe that eotaxin and eosinophils can play a key role in allergic asthma.
0 引言
气道炎症是支气管哮喘的病理基础.其主要病理变化特征是嗜酸粒细胞（Eos）、淋巴细胞、肥大细胞浸润引起的气道粘膜水肿、粘液分泌、上皮细胞脱落和支气管平滑肌痉挛［1-3］ .Eos在气道炎症和气道高反应性中起着中心作用.尽管支气管哮喘发病机制的研究有了很大进展，但是许多新的治疗措施仍不能完全根治哮喘.近年来，趋化因子的发现引起人们的注意，其特点是对多种炎性细胞具有趋化和激活功能，在炎症反应中的作用也日益受到重视.Eotaxin属于C-C类趋化因子，对Eos具有选择性的趋化作用［4，5］ .在过敏性炎症反应中，Eotaxin能特异性地募集、趋化和激活Eos.我们主要探讨过敏性哮喘中Eotaxin对Eos功能的影响及与气道炎症和支气管哮喘的关系.
1 材料和方法
1.1 动物模型 豚鼠40只，由第一军医大学实验动物中心提供.体质量250～350g，性别不拘.随机分为哮喘组（n=20）和对照组（n=20）.哮喘组用100g・L-1 卵蛋白（Ova，Sigma公司）1mL，ip，致敏.2wk后，以10g・L-1 Ova液雾化吸入诱发哮喘.每日1次，连续5d.对照组以等量生理盐水雾化吸入致敏及诱发哮喘.
1.2 支气管肺泡灌洗液（BALF）收集及检测 2组豚鼠诱发哮喘后，各取10只以2.5mL・kg-1 水合氯醛腹腔内麻醉.剖开胸腔，剪断气管后分离肺脏.用生理盐水冲洗肺表面血污，行支气管肺泡灌洗（BAL）.每次注入37℃生理盐水5mL，留置3min后回收BALF，铜网过滤，重复3次.注射总量15mL，回收率超过80%.离心BALF，沉淀物经Wright染色后行细胞分类、计数.
1.3 肺组织病理标本制备 诱发哮喘后，另取豚鼠各10只.2.5mL・kg-1 水合氯醛麻醉后，剖开胸腔，切开左心房，由右心室快速注入4℃生理盐水100mL，冲洗干净肺血管内血液.以40g・L-1 多聚甲醛500mL冲洗肺脏至完全变白为止.取出肺组织，置于多聚甲醛液体中后固定.行梯度乙醇脱水，包埋、固定、切片、HE染色.
1.4 原位分子杂交 根据Genebank中登录的Eo-taxin（Accession U18941）基因序列，由Oligo5软件设计，大连TaKaRa公司合成寡核苷酸探针并在5′末端用地高辛标记.Eotaxin寡核苷酸探针序列:5′CAG TCG CTG AAA GGA GAT CTT CTT ATT GGT CAC ACG AAA GCA GCA GGC AC3′.灌注后的肺组织及时采用含有1mL・L-1 DEPC的40g・L-1 多聚甲醛/0.1mol・L-1 PBS予以固定.常规脱水、石蜡包埋.玻片采用多聚赖氨酸处理，石蜡切片脱蜡至水，玻片滴加胃蛋白酶暴露mRNA.0.5mol・L-1 TBS洗3次，双蒸水洗1次，行预杂交、杂交.加入含地高辛标记探针的原位杂交液，洗涤后滴加封闭液及地高辛抗体.DAB显色，计算机图像分析，测量单位面积内的Eotaxin mRNA的阳性细胞数.
1.5 豚鼠肺组织总RNA的提取 新鲜肺组织标本采集后，液氮中保存.取冰冻组织50～100mg在液氮中磨碎成纯粉末，加入1mL Trizol溶剂中，4℃离心，取上清加入0.2mL氯仿，室温孵育.离心后再加 入0.5mL异丙醇，室温孵育，离心去除上清液，加入750mL・L-1 乙醇（DEPC处理）1mL混匀，洗涤沉淀，4℃离心后收集RNA沉淀，室温干燥.紫外分光光度计检测A260nm ～A280nm 值，纯化的RNA比值在1.9～2.0之间.
1.6 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 配制10g・L-1 琼脂糖变性凝胶.将已制备好的RNA样品各取10～20μg，溶于11μL DEPC水，加入5μL10×MOPS（3-［n-吗啉］-丙磺酸），9μL甲醛，25μL去离子甲酰胺，4μL上样缓冲液（含2.5g・L-1 溴酚蓝，400g・L-1 蔗糖），65℃孵育、冷却后离心.将凝胶放入1×MOPS缓冲液的电泳槽中预电泳5min，顺序加样.3～4V・cm-1 电泳至溴酚蓝染料迁移至凝胶下游3/4处，紫外灯下观察.真核细胞28s和18s RNA比值为2∶1，表明RNA无降解.
1.7 Northern杂交 末端地高辛标记的Eotaxin寡核苷酸探针、β-actin探针在High SDS缓冲液中稀释为1～10nmol・L-1 .印迹法将RNA转移至尼龙膜上，紫外交联，固定RNA.将尼龙膜放入杂交袋中，42℃预杂交1h，加入地高辛标记探针的杂交液，杂交后室温下充分洗膜.NBT/BCIP比色法显色检测.杂交后对各条带进行密度灰度扫描，对比其RNA表达量的差异.
统计学处理:数据采用SPSS8.0统计学软件行t检验，P&<0.05为显著性差异.
2 结果
2.1 过敏性哮喘豚鼠气道炎症变化 以卵蛋白诱发豚鼠哮喘连续5d，哮喘组豚鼠肺组织气道粘膜水肿明显，表现为气道粘膜上皮细胞肿胀、细胞核被推至细胞边缘，部分气道上皮组织完全变性、坏死、脱落、支气管腔狭窄，甚至完全闭塞、粘液栓形成等.支气管周围血管扩张、充血，粘膜及粘膜下层可见有大量炎性细胞浸润，以Eso、单核细胞及淋巴细胞为主（Fig1）.对照组豚鼠支气管粘膜无明显水肿，支气管腔无闭塞，周围未见明显炎症细胞浸润.
2.2 过敏性哮喘豚鼠BALF中细胞计数与分类变化 哮喘组豚鼠BALF中细胞总数及Eso比例较对照组明显升高（P&<0.01），巨噬细胞比例较对照组显著下降（P&<0.01）.中性粒细胞及淋巴细胞比例与对照组比较相差不明显（P&>0.05，Tab1）.
2.3 Eotaxin在哮喘豚鼠肺组织中的表达 哮喘组支气管粘膜及粘膜下层可见大量Eotaxin mRNA染色阳性的棕黄色细胞，高倍镜下可见细胞胞质内棕黄色颗粒.提示过敏性哮喘豚鼠气道粘膜有Eotaxin mRNA表达（Fig2，3）.正常对照组豚鼠未见明显Eotaxin mRNA阳性细胞.计算机图像计数分析显示哮喘组的Eotaxin mRNA阳性细胞数・mm-2 （x ±s）为（198±46），明显高于对照组（16±8，P&<0.01）.
表1 过敏性哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中细胞计数与分类变化 略
图1 － 图4 略
3 讨论
Eotaxin是一种Eos选择性趋化剂，属于β-亚族趋化因子.研究发现其对Eos具有特异性的激活、趋化作用，对其他白细胞的作用则较弱［5，6］ .近10a来，研究发现哮喘气道炎症中Eos是最重要性的炎性效应细胞.但是，对于Eos在支气管哮喘中的作用机制
图5 略
及途径了解的并不清楚.因此，了解Eos在哮喘发病中的地位对于改进治疗哮喘的方法可能有较大帮助.
我们以Ova诱发豚鼠哮喘，探讨Eotaxin对Eos功能与支气管及肺组织炎症和哮喘的关系.实验中可见哮喘豚鼠BALF中细胞总数明显升高并以Eos为主.在哮喘豚鼠肺组织中可见气道粘膜水肿、上皮脱落、粘液栓形成及气道闭塞.同时，可见气道周围大量炎性细胞浸润，以Eos为主.采用原位分子杂交观察气道上皮及周围肺组织，可见Eotaxin mRNA表达较对照组明显增加.从肺组织中提取的总RNA，采用Northern blot杂交也发现Eotaxin mR-NA较对照组表达明显升高.提示在过敏性哮喘中，Eotaxin mRNA表达增强，Eotaxin释放增加，进而活化Eos，趋化Eos至肺组织，造成气道损伤，引发支气管哮喘.Eos在过敏性炎症中起着重要作用.
Eos可被多种炎性介质所激活.主要有血小板激活因子（PAF）、血三烯类（LTs）、白介素-5（IL-5）等.以往认为Eos的趋化及肺内募集与IL-5，PAF，C5a有关.但是使用这些物质的拮抗剂，不能完全抑制Eos肺内的募集.显然尚有其他物质具有Eos的趋化作用.国外学者发现趋化因子类（chemokines）对Eos可能具有更重要的作用.如:巨噬细胞炎性蛋白-1α，1β（MIP-1α，1β），单核细胞趋化蛋白1，2，3（MCP-1，2，3），RANTES，IL-8等都具有一定的Eos趋化功能.但是，目前认为Eotaxin是最重要的Eos趋化蛋白，在Eos的激活和趋化作用中发挥着更重要的作用［5］ .Eotaxin可有多种炎性细胞所分泌，如:淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞和Eos等.过敏反应可引起这些细胞释放Eotaxin，进而引起Eos激活［5，6］ .用免疫组化方法研究过敏性鼻炎患者的鼻粘膜上皮细胞中发现有Eotaxin mRNA表达，给予动物吸入Eotaxin，引起气道Eos浸润［6，7］ .Eos含有多种毒性颗粒［8］ ，如:主碱性蛋白（MBP）、嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ECP）、嗜酸粒细胞毒性蛋白-X（EPX）、氧白由基、细胞因子、淋巴因子及炎性介质等，它们对组织具有重要的炎性损伤作用.Eos细胞膜上有多种受体，如:细胞因子受体、免疫球蛋白受体、炎性介质受体、PAF受体、C5a受体、趋化因子受体等.炎性介质如趋化因子作用于这些受体可激活Eos.研究发现C-C类趋化因子受体共有5种，包括CCR1～CCR5.在Eos细胞膜有Eotaxin的特异性受体CCR3.CCR3主要位于Eos细胞膜，在其他白细胞较少见［9，10］ .因此，Eotaxin对Eos的作用是特异性的.研究还发现当Eotaxin趋化Eos游动至炎症反应区域时，在L-selectin的帮助下，与局部内皮细胞粘附，实现垮膜运动，进入炎症反应部位.随后，释放多种炎性介质和毒性蛋白，如:MBP，ECP， EPX，IL-5，IL-6，RANTES，PAF，氧白由基等，造成气道的炎症反应，引起气道高反应性和支气管哮喘发作［11，12］ .我们认为Eotaxin在过敏性哮喘气道炎症反应中发挥重要作用，抑制炎性细胞、组织细胞表达Eotaxin及阻止Eotaxin趋化和激活Eos可能是防治哮喘一个新的措施.
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