作者：张航向 任平 黄裕新 李源 黄熙 刘芳
【关键词】 脾虚
关键词: 脾虚;生长抑素;四君子汤;肠内分泌细胞;免疫组织化学;医学，中国传统
摘 要:目的 探讨脾虚证与生长抑素（somatostain，SS）内分泌细胞（D细胞）数量变化的关系. 方法 用免疫组化链酶亲合素过氧化酶复合技术（SABC）对利血平脾虚大鼠模型胃粘膜和患者胃粘膜组织的D细胞染色;观察各组D细胞的形态和数量变化. 结果 和对照组相比，脾虚大鼠模型7d组D细胞数升高（43.4±3.1vs78.6±4.6，P&<0.01），强阳性细胞率下降［（34.6±2.5）%vs（24.1±3.5）%，P&<0.01］;脾虚大鼠模型14d组D细胞强阳性细胞率升高［（34.6±2.5）%vs（46.4±9.0）%，P&<0.05］;四君子汤治疗组大鼠与正常对照组间D细胞数（43.4±3.1vs41.7±3.7）及强阳性细胞率无显著差异［（34.6±2.5）%vs（33.1±1.7）%，P&>0.05］.患者脾虚组D细胞阳性数（70.4±10.1），（38.1±6.4），（45.4±8.6），（P&<0.01）及强阳性率较胃热、肝火上炎组均增加（43.2±8.7）%，（17.9±6.6）%，（21.8±7.5）%（P&<0.01）. 结论 脾虚证大鼠和患者胃粘膜组织中D细胞阳性和强阳性细胞率增加，提示脾虚患者临床出现腹胀、纳差等症状可能是由于SS内分泌细胞功能增强所致.
Keywords:spleen deficiency;somatostatin;Sijunzi decoc-tion， enteroendocrine cells; immunohis-tochemistry;medicine，Chinese
Abstract:AIM To investigate the relationship between so-matostain enteroendocrine cells and spleen-asthenia syndrome in rats and patients.METHODS Short-term and the long-term rat models of spleen-asthenia syndrome were treated by reserpine for seven days and fourteen days.The patients with spleen-asthenia syndrome（12），stomach-heat syndrome（11）and flaming-up of liver-fire syndrome（9）were selected by differential diagnosis and immunohistochemical SABC method was employed to stain the D cells of gastric antrum.The variation of appearance and quantity of endocrine cells were observed by light microscope.RESULTS In the rat model of seven days，as compared with the controls，the number of D cells increased（43.4±3.1），（78.6±4.6）（P&<0.01），and the percentage of strongly positive D cells reduced（34.6±2.5）%，（24.1±3.5）%（P&<0.01）.In the rat model of fourteen days，the percentage of strongly positive D cells in-creased（34.6±2.5）%，（46.4±9.0）%（P&<0.01），In pa-tients with spleen-asthenia syndrome the quantity（70.4±10.1），（38.1±6.4），（45.4±8.6）%and the percentage of strongly positive of D cell（43.2±8.7）%，（17.9±6.6）%，（21.8±7.5）%（P&<0.01）increased as compared with the other groups.CONCLUSION Quantity and the percentage of strongly positive D cells of gastric antrum increased in spleen-asthenia syndrome，and different symptoms of spleen-asthenia may be related to the increased function of D cells.
0 引言
中医认为脾主运化，脾失健运时可出现与消化系统运动功能障碍相类似的临床表现，脾虚时消化系统功能处于紊乱的病态.近年来研究发现，生长抑素（somatostain，SS）、胆囊收缩素（CCK）、胃动素（Mot）等胃肠激素可直接或间接调节胃肠道消化、吸收、分泌和运动等功能，其在外周和中枢浓度的增加或减少均可引起胃肠道功能失调［1-4］ .近期有学者观察到脾虚患者及脾虚模型大鼠血浆和胃窦组织间的SS含量均明显高于对照组［5］ ，因此研究脾虚证与这两种激素及其内分泌细胞的关系对探讨脾虚证的本质有重要意义［6-8］ .我们对实验性脾虚大鼠胃窦粘膜SS内分泌细胞（D细胞）及脾虚和非脾虚患者D细胞的改变进行了观察.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性SD大鼠25只，体质量（250±20）g，第四军医大学实验动物中心提供.四君子汤、六味地黄汤均由本院中药房提供.将药物于清水中浸泡30min煮沸后，文火煎30min，再浓缩至3.0kg L-1 浓度.利血平（1g L-1 ）上海医科大学红旗制药厂提供;兔抗大鼠SS抗体由第二军医大学神经生物教研室提供;SABC试剂盒由博士德公司提供;DAB由Sigma公司提供.动物分组及脾虚动物模型的建立:25只大鼠，随机等分为5组:①正常对照组，每只给予生理盐水0.2mL d-1 股四头肌注射，同时ig蒸馏水2.0mL d-1 ，14d;②脾虚模型Ⅰ组，每只给予利血平0.3mg kg-1 d-1 股四头肌注射，并ig蒸馏水2.0mL d-1 ，7d;③脾虚模型Ⅱ组，造模方法同脾虚模型Ⅰ组，14d;④四君子汤组和六味地黄汤组，在用利血平（用法用量同上）的同时分别ig四君子汤和六味地黄汤，2.0mL d-1 ，14d.
对临床作胃镜检查拟取胃粘膜组织进行病理分析的患者，采用辩病与辨证结合的分型原则，选择胃镜及西医诊断为慢性胃炎、浅表性胃炎、胃溃疡、胆汁返流性胃炎等而中医诊断为脾虚、肝火上炎、胃热证者，各证辨证符合“中医虚证辨证参考标准”［6］ 及《中医诊断学》的诊断标准.其中辨证符合脾虚者12（男7，女5）例，年龄27～69（45±7）岁;辨证符合肝火上炎证者9（男5，女3）例，年龄24～63（43±8）岁;辨证符合胃热炽盛证者11（男7，女4）例，年龄33～67（46±6）岁.各组间性别、年龄比较无显著差异性.以上各组均除外糖尿病、肾病、肝病、恶性肿瘤、心血管疾病、呼衰、胰腺疾病所致的消化功能障碍患者.
1.2 方法 大鼠脾虚模型Ⅰ组于造模后7d，其余各组于造模后14d，禁食不禁水12h，次日上午08:00～09:00，戊巴比妥钠（40mg kg-1 ，ip）麻醉后，Bouin液灌注固定.取胃组织，后固定2h，然后入300g L-1 蔗糖磷酸缓冲液至组织块沉底.胃窦组织于恒冷箱冰冻切片机做连续冠状冰冻切片，片厚10μm;患者 作胃镜前停用各种药物1wk，行纤维胃镜检查时取胃窦部粘膜两块，组织经40g L-1 甲醛固定3h后脱水、石蜡包埋，石蜡块用石蜡切片机做连续冠状切片，片厚5μm，组织切片分别贴于明胶载玻片（患者组织切片用檬酸型抗原修复液进行抗原修复），按免疫组化试剂说明进行染色.SS抗血清工作稀释度为1 1000;同时分别用正常兔血清和PBS取代SS抗血清，做替代和空白对照，染色结果均为阴性.用Olympus（BH-2）显微镜选择阳性细胞较集中的区域，由一位计数者在短期内观察每高倍视野（1 400）下染色阳性细胞数和强阳性细胞数，计算强阳性细胞率（强阳性细胞除以阳性细胞），阳性细胞为细胞质内有蓝色反应物，胞核多为阴性，部分细胞核可被反应产物掩盖.强阳性细胞特征为胞质着染浓密，呈蓝黑色，超过胞体3/4，核空白区变小甚至消失.每个病理切片选3个高倍视野.
统计学处理:计算强阳性细胞百分率，对各组的阳性细胞及强阳性细胞百分率采用x ±s表示;用双侧t检验进行组间差异的比较.
2 结果
2.1 大鼠脾虚模型胃窦D细胞 免疫反应阳性的D细胞，胞质内有蓝色反应物，胞核为阴性，主要分布于胃窦粘膜的中、下层，偶见于上层.D细胞形态不规则，有的细胞发出细长突起，末端呈棒状，伸向邻近细胞，有的D细胞顶部可达腺腔.D细胞测定结果见Tab1.
表1 脾虚模型大鼠胃窦粘膜D细胞的变化 略
2.2 脾虚患者胃窦D细胞 免疫反应阳性的D细胞，胞质内有蓝色反应物，胞核为阴性，主要分布于胃窦粘膜的中、下层，偶见于上层.D细胞形态不规则，切面呈梭性、三角形或不规则型.D细胞测定结果见Tab2.
表2 脾虚患者胃窦粘膜D细胞的变化 略
3 讨论
SS为14个氨基酸组成的环肽，有多种分子形式，主要为SS14 和SS28 .在体内分布十分广泛，除胃肠道外，还存在于下丘脑和外周神经［9-11］ .在消化系统中SS主要分布与胃及肠壁神经丛的D细胞中，并由D细胞分泌.分泌生长抑素的D细胞广泛分布于胃肠道，以胃窦部为多，在肠内愈向下愈少.D细胞的分泌活动具有明显的旁分泌性质，即所释放的SS可调节周围细胞的机能活动.人类胃肠中SS90%以上存在于粘膜中，SS的全身含量胃肠道占70%、脑占25%，SS对消化系统的生物学作用主要是抑制，抑制胃酸分泌、消化道吸收及胃肠运动等功能，还能抑制其他胃肠激素的释放［12］ .
综上所述，动物实验和临床均观察到脾虚证时胃 窦粘膜组织D细胞合成、分泌功能的改变，这可能是脾虚证时出现一系列消化道功能紊乱的主要原因之一.动物实验提示四君子汤治疗脾虚证可能是通过调整上述内分泌细胞的功能而得以实现的.随着对脾虚证与胃肠激素及其内分泌细胞关系研究的深入，必将对脾虚证本质及脾虚证的辨证和治疗产生有益的影响.
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