作者：杨连君 王文亮 司晓辉
【关键词】 细胞周期相关蛋白
关键词: 细胞周期相关蛋白;肝细胞癌;免疫细胞化学
0 引言
肿瘤细胞的发生和增殖与细胞周期蛋白（Cyclin）及其相关分子Cyclin依赖性蛋白激酶（CDK）和CDK抑制蛋白（CKI）的调控密切相关［1］ .关于Cyclin及其调控分子在培养的原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）细胞中表达的定位情况尚未见报道.我们采用免疫细胞化学技术检测Cyclin D1及其相关分子CDK4和CKI家族中的p27Kip1在培养的肝癌细胞系HCC-9204中的表达情况.
1 材料和方法
1.1 细胞来源 人肝癌细胞系HCC-9204和对照用的正常人肝细胞系QZG为本室保存.于含盖玻片的6孔板内用含100mL・L-1 新生牛血清的RPMI1640培养液培养.待细胞生长至单层时，取出玻片，PBS缓冲液洗，950mL・L-1 乙醇固定15min，再用PBS洗后4℃备用.
1.2 主要试剂 鼠抗人Cyclin D1，CDK4和p27Kip1mAb均为美国Santa Cruz公司产品.DAB为美国Sigma公司产品.免疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.
1.3 染色方法 ①细胞片入7.5mL・L-1 h3 O2 内，37℃，10min;②加正常羊血清，37℃，30min;③分别加鼠抗人Cyclin D1，CDK4或p27Kip1mAb，以PBS作为阴性对照，4℃过夜;④加生物素化羊抗鼠IgG，37℃，30min;⑤加ABC复合物，37℃，30min.上述各步间均用PBS洗;⑥DAB显色后脱水，透明，封片.
1.4 结果判断 阳性信号为棕黄色.每个细胞片随机选取不相重叠的视野，计数300个细胞，观察其是否为阳性及其染色部位.
2 结果
Cyclin D1，CDK4和p27Kip1在HCC-9204细胞表达的阳性率及其定位情况见表1、图1和图2.与在HCC-9204细胞中的表达情况相比，QZG细胞中的Cyclin D1和CDK4相对较弱，而p27Kip1相对较强.所有阴性对照中均为阴性.
图1 略
3 讨论
细胞周期的内源性调控主要是通过Cyclin-CDK-CKI进行网络调控来实现的.Cyclin和CKI分别对CDK进行正反调控.Cyclin D1是Cyclin中与细胞周期G1期密切相关的主要类型，在正常组织中表达水平低.近年来发现，Cy-clin D1在多种肿瘤组织中呈异常的高表达［2，3］ .CDK4是CDK家族中的主要类型.p27Kip1是近年来新发现的一种CKI，对细胞G1期限制点具有重要的调控作用.p27Kip1蛋白水平在静止期细胞中较高，在多种肿瘤组织中呈异常的低表达［4］ .在我们的研究中，肝癌细胞中的Cyclin D1和CDK4强于正常肝细胞对照，而p27Kip1相对较弱，与上述观点一致.以往报道多认为Cyclin D1表达主要为细胞核阳性［2］ .我们观察到HCC-9204细胞主要为细胞质染色.说明虽然肝癌细胞中的Cyclin D1与CDK相互作用是细胞核事件，CyclinD1也可能分布并贮存于细胞质.本研究表明，肝癌细胞的p27Kip1表达主要为细胞质阳性，CDK4主要为细胞核阳性，与以往的报道一致［4］ .
Cyclin D1与CDK4结合后促进RB蛋白的磷酸化，从而解除RB对核转录因子E2F的抑制效应，启动DNA的合成，加快细胞由G1期向S期的过渡［1］ .p27Kip1对上述过程起负调控作用.因此，Cyclin D1的过量表达或p27Kip1的低表达可导致细胞的G1期缩短，从而促进肿瘤细胞的恶性转化.我们的研究表明，Cyclin D1，CDK4和p27Kip1在HCC-9204细胞都有一定程度的表达，为采用HCC-9204细胞进行肝癌的细胞周期蛋白及其相关分子的研究奠定了基础.
参考文献
［1］Grana X，Reddy EP.Cell cycle control in mammalian cells:Role of cyclins，cyclin dependent kinases（CDKs），growth sup-pressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors（CKIs）［J］.Oncogene，1995;11（2）:211-219.
［2］Bartkova J，Lukas J，Muller H et al.Cyclin D1protein expres-sion and function in human breast cancer ［J］.Int J Cancer，1994;57（3）:353-361.
［3］Nishida N，Fukuda Y，Komeda T et al.Amplification and over-expression of cyclin D1gene in aggressive human hepatocelluar carcinoma ［J］.Cancer Res，1994;54（12）:3107-3110.
［4］Anayama T，Furihata M，Ishikawa T et al.Positive correlation between p27Kip1expression and progression of human esophageal squamous cell carcinoma ［J］.Int J Cancer，1998;79（4）:439-443.转贴于