关于预变性神经移植促进神经再生的动物实验

【关键词】 神经再生
　　关键词: 神经再生;神经移植;动物，实验
　　摘 要:目的 通过兔腓总神经不同时限预变性神经移植，从组织学、免疫组织细胞化学、电生理、超微结构等多方面对神经功能恢复进行探讨. 方法 家兔42只分为A，B，C，D，E，F，G7组:A，B，C，D，E，F组分别为预变性0，4，7，14，21和28d移植组，G组动物双侧腓总神经分别作新鲜神经移植和预变性神经移植. 结果 2wk预变性神经移植与新鲜神经移植相比可显著降低轴突再生起初延迟期（由3.04～0.04d），提高神经生长速度（由1.73～2.59mm・d-1 ），促进N-MCV（由25.14～29.21m・s-1 ），增进轴突通过率（由81.2%～91%）.组织学观察预变性2wk再生轴突比新鲜神经移植组成熟，髓鞘化程度高而且早. 结论 预变性2wk神经移植无论在质和量上均优于新鲜神经移植，其次是预变性1wk神经移植组.预变性4d和3wk也有增强神经再生的作用.
　　
　　Keywords:nerve graft;nerve regeneration;animals，labora-tory
　　
　　Abstract:AIM To explore the effect of predegenerated nerve grafting on nerve regeneration.METHODS We re-viewed nerve regeneration of different period predegenerated graftting through histological;immunocytochemical;electron micoscopic and electrophysiological studies.The rabbits were pided into7experimental groups for different periods（0，4，7，14，21，28d）of nerve graftting.In A，B，C，D，E，F groups，both sides of the rabbit peroneal nerve were cut and allowed to undergo predegneration for0，4，7，14，21，28days;a10mm segment was used as an autologous nerve graft and transposed to a10mm long nerve defect on the con-tralateral side.In G group，the left side（Predegenerated nerve graft for14d）was compared to the right side（Fresh nerve graft）.RESULTS Graftting predegenerated for14days shortened significantly the initial delay period of axonal regeneration（3.04～0.04d），accelerated the axonal grow rate（1.73～2.59mm・d-1 ），increased the quantity of re-generated axon，and raised nerve muscle conduct velocity（25.14～29.21m・s-1 ）than fresh nerve grafts，also ma-tured earlier and better than ones for fresh nerve graft.CON┐CLUSION Grafts degenerated for14days can enhance sig-nificantly nerve regeneration than fresh nerve grafts，then grafts degenerated for7days.Grafts degenerated for4and21days can also enhance axonal regeneration lightly.It is suggested that grafts degenerated can provide better opportu-nity for axonal growth.
　　
　　0 引言
　　
　　1977年，Robert等［1］ 通过大鼠坐骨神经2wk预变性神经移植发现预变性神经移植无论在质和量上均优于新鲜神经移植.以后的20a中，许多研究运用现代技术对预变性神经移植从各个方面进行评价，均认为优于新鲜神经移植［2-4］ .但不同的报道在某些评价指标上所得结果很不一致，有的甚至截然相反，且对于预变性增强神经再生的精确机制还不完全清楚.我们通过兔腓总神经不同时期预变性神经移植实验，从组织学、免疫组织细胞化学、电生理、超微结构等方面对神经功能恢复及神经损伤后退变进程综合评价.目的是为了弄清:①预变性神经移植究竟在哪些方面优于新鲜神经移植;②预变性神经移植中胞体和神经段何者起更重要的作用.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 家兔42只，体质量2.3～2.6kg，雌雄不拘，由本校实验动物中心提供，混合饲料单笼喂养.实验模型神经为腓总神经.
　　
　　1.2 方法 42只兔随机分为7组:A，B，C，D，E，F，G组.A，B，C，D，E，F组分别为预变性0，4，7，14，21和28d组，其中预变性0d组即为新鲜神经移植组.B，C，D，E，F组于腓总神经自坐骨神经分出处以远1.5cm处用锐利刀片切断，使断端相距至少15mm，避免神经自然生长.A组动物切开皮肤，暴露但不切断神经.G组只切断右侧腓总神经.B，C，D，E，F组分别于术后4，7，14，21和28d重新暴露已切断的神经，取远段1.5cm变性神经段移植修复对侧神经，双侧交叉移植.A组2wk后重新暴露腓总神经，同法切取1.5cm神经段左右交叉移植.G组2wk后将右侧预变性神经段移植到左侧新鲜受体床，左侧新鲜神经段移植到右侧预变性受体床.
　　
　　1.3 检测
　　
　　1.3.1 物理检查 采用Young和Gutmann最先提出的方法pinch-test测定感觉神经的生长速度［5］ .神经修复后2，4，6，8和10d，测量轴突生长最远点至近端吻合口的距离即为感觉轴突生长距离.根据5组数据建立数学模型，横坐标为时间，纵坐标为生长距离的回归方程，通过回归方程求出X轴截距即为轴突再生起初延迟期，斜率即为轴突生长速度.
　　
　　1.3.2 电生理 术后6wk，SRD-4型双线电生理示波器（国产）测定神经肌肉传导速度（N-MCV）.刺激电极置于移植段，接收电极置于胫前肌.
　　
　　1.3.3 组织学观察 神经移植术后2，4和6wk分别取移植段近、中、远处标本，150mL・L-1 中性甲醛固定1wk，系列浓度乙醇脱水，石蜡包埋，Gless染色，在计算机成像系统下计数每个断面轴突数量，比较远近断端，计算轴突通过率.术后6及8wk标本行砂罗硌花青R染色，观察髓鞘形成.
　　
　　1.3.4 免疫组织细胞化学 术后2和4wk的石蜡切片用鼠抗神经纤维丝蛋白（Neurofilament-68KD，NF，美国Zymed公司提供）作SABC法免疫组织细胞化学染色，观察再生轴突神经纤维丝发育成熟情况.
　　
　　1.3.5 亚显微结构观察 术后4和8wk标本修成1cm×1.5cm×1.5cm大小组织块，2.5mL・L-1 戊二醛固定1d（40℃），1mL・L-1 四氧化锇2h，经漂洗、脱水后，Epon812包埋，瑞典LKB-V型超薄切片机切片，日本产JEX-2000EX电子显微镜观察.
　　
　　2 结果
　　
　　术后伤口无1例感染.动物全部成活良好.术后 6wk开始各组动物足下垂逐渐消失.动物术后出现展趾反射的时间为:C，D组6wk，A，B，E组7wk，F组8wk.
　　
　　2.1 起初延迟期和轴突再生速度 轴突再生起初延迟期A组动物最长，D组动物多数不存在起初延迟期阶段.经方差分析A组与其他各组比较差异均十分显著.神经再生速度以D组最快，与其余各组比较差异均非常显著.其次是C组，与其余各组比较差异也非常显著.A，B，E各组动物生长速度无明显差异，但均快于F组.电生理:D，C，B组N-MCV最快，其次是A和E组，F组最慢（Tab1）.
　　
　　表1 各组神经再生参数　略
　　
　　2.2 组织学观察（光学显微镜） 术后4wk各取近端吻合口远近1cm处标本.D组动物轴突通过率与C组比较无明显差异，与A，B和E组比较明显增高，与F组比较增高非常显著.C组显著高于F组，但与A，B及E组差别不显著.F组通过率最低（Tab1）.砂罗硌花青R法染色，术后6wk D组动物大量成熟髓鞘出现.C组动物中等量髓鞘出现.A，B，E及F组偶见髓鞘.C组动物于术后8wk成熟髓鞘数量进一步增多.A，B组术后8wk髓鞘数量增多.F组术后8wk仍仅见少量髓鞘.E，F组纤维组织增生比较明显（Fig1）.
　　
　　2.3 免疫组织细胞化学 D组动物术后2wk兔抗NF-68KD免疫组化染色见大量着色的神经纤维丝.C组仅见少量着色的神经纤维丝.A，B，E及F组未见着色神经纤维丝（Fig2）. 转贴于 　　2.4 电镜观察 D组动物术后4wk即有完整髓鞘形成（Fig3）.髓鞘内轴突轴浆丰富均匀，其内可见大量的神经丝及线粒体，髓鞘周围有胶原纤维增生，髓鞘呈板层状结构.无髓轴突数量也较多.由于轴突的生长成熟，雪旺管神经内膜管被扩张.A组显示大量雪旺细胞增生，成纤维细胞增生，除此之外尚有破碎的髓鞘存在.F组术后4wk术前已塌陷的雪旺管被增生的SC及长入的轴突所扩张，周围有胶原纤维增生及成纤维细胞存在.A组再生的轴突术后4wk仅见少量成熟髓鞘，术后8wk才有大量完整髓鞘形成.B，C及E组髓鞘成熟明显早于A组.
　　
　　图1 － 图3 略
　　
　　表2 G组再生轴突各检测指标值　略
　　
　　2.5 G组动物 左侧为新鲜受体床+预变性神经移植，右侧为预变性受体床+新鲜神经移植.左右侧各测轴突再生起初延迟期、轴突再生速度、轴突通过率、N-MCV及组织学观察（Tab2）.左侧无论是轴突再生速度、N-MCV，轴突通过率均高于右侧，只是起初延迟期低于右侧.组织学观察，髓鞘成熟也比右侧要早.
　　
　　3 讨论
　　
　　实验结果显示预变性神经移植可显著降低轴突再生起初延迟期增强轴突生长速度.由于起初延迟期的降低和生长速度的加快，新生的轴突可尽早达到靶组织，避免了靶组织如肌肉的纤维化及运动终板的退变，促进损伤神经所支配器官的早期恢复.预变性4d即可将起初延迟期由3.1d降至0.8d（约19h）.预变性2wk对于起初延迟期的降低最为显著，多数为0d.预变性神经移植降低起初延迟期的效应可能是由于胞体对第一次损伤所产生的反应，当第二次损伤时胞体已经处于再生状态，含有轴突再生所需要的物资.轴突再生速度很大程度上表示了轴突再生能力的强弱.D组（预变性2wk组）轴突再生速度最快.F组（预变性4wk）轴突再生速度最慢，但与A，E组相比并没有显著差别，说明预变性4wk的神经段用来修复神经缺损仍能得到较为满意的结果.不过要想得到最佳结果，神经修复前预变性2wk左右是合适的.神经变性2wk时，SC（Schwann cell）增殖及神经营养因子的合成均达高峰，内膜管内的变性物质也已被清除干净，遗留中空的管，便于轴突的生长.神经干中再生轴突的数量反应着神经再生质量.预变性2wk轴突通过率最高，这与轴突再生速度是吻合的.神经丝中NF-L主要于神经发育或轴突再生的早期阶段出现［6］ ，一定程度上反映再生轴突的质量.我们用鼠抗神经纤维丝蛋白（Neurofilament-68KD）行免疫组化法染色主要是观察轴突再生早期阶段，各组NF（neurofilament）表达情况.结果显示D组神经丝较多，且出现比其余各组早.轴索中的NF一定程度上反映了再生轴索功能的恢复.N-MCV不但能反映神经干传导功能，也能反映神经肌肉接头的功能，D组N-MCV传导速度最快，明显快于新鲜移植组，但与B，C组相比相差不明显，说明预变性4d组、1wk组也能很好地促进神经功能的早期恢复.组织学观察也显示预变性2wk组神经再生优于其他各组.预变性2wk组髓鞘恢复最早，成熟也最好.从我们以前的实验及文献报道看，神经预变性2wk时，SC增殖达到高峰，形成沿内膜管排列的Bungner氏带［7］ .由SC产生的各种神经营养因子，如NGF，IGF-1也于2wk左右达高峰［8，9］ .众所周知髓鞘是由SC形成的，而NGF有促髓鞘成熟的作用，预变性2wk时SC和NGF均达最大值，故能促进髓鞘尽早尽快成熟.
　　
　　G组动物结果显示左侧在轴突通过率、轴突生长速度、N-MCV上均优于右侧.组织学观察也显示左侧再生轴突直径比右侧粗，髓鞘成熟也早于右侧.只有起初延迟期右侧比左侧明显缩短.这就说明轴突再生的开始几天预变性胞体对轴突再生的增强效应占优势，因为预变性使胞体合成了大量轴突生长所需的物资，神经修复后轴突生长能即时而迅速.但几天以后，新切断的神经其胞体也处于再生状态，合成了轴突生长所需的物资，预变性胞体的增强效应已不明显了，这时预变性神经段由于SC增殖和NGF合成已达高峰，内膜管内崩解破碎的物质也已清除干净［8］ ，而新鲜神经段内还有大量崩解破碎物质，且SC增殖及神经营养因子的产生正处于上升阶段.故这段时期预变性神经段对轴突生长的影响就占了优势.预变性神经其胞体和神经段对于轴突生长都有增强效应.如果将二者结合起来应该可以达到最佳结果.
　　实验结果也显示了这一点:D组无论在轴突生长速 度、轴突通过率、N-MCV，轴突再生起初延迟期上均优于G组.2wk预变性是最优的，其次是1wk，预变性4d也有增强轴突再生的作用，预变性3wk和4wk结果比新鲜神经移植差.预变性神经移植在降低轴突再生起初延迟期、促进轴突生长速度、增进轴突通过率、提高N-MCV方面优于新鲜神经移植.组织学和免疫组织细胞化学显示预变性神经移植能促进轴突尽早尽快成熟，髓鞘化程度高.
　　参考文献:
　　
　　［1］Robert A，Dickson E.Delayed（degenerate）inter-fascicular nerve grafting:A new concept in perpheral nerve repair ［J］.J Surg（Br），1977;（64）:698-702.
　　［2］Martin O，Silvio V，Theo H.Regeneration of adult rat sensory axons into intraspinal nerve grafts:Promoting effect of conditin-ing leision and grafts predegeneration ［J］.Exp Neurol，1994;（129）:194-206.
　　［3］Zhao Q，James M.kerns.Effects of predegeneration on nerve regeneration through silicone Y-chembers ［J］.Brain Res，1994;（633）:97-104.
　　［4］Mitsuo O，Masahiko W，Yoshikazu.Nerve regeneration in pre-degeneration basal laminal grafts:The effect of duration of pre-degeneration on axonal extention ［J］.Exp Neurol，1994;（128）:216-225.
　　［5］Hotmquist B，Martin K，James M，Kerns.A mathematical model for regeneration rate and initial delay following surgical repair of peripheral nerves ［J］.J Neurosci Methods，1993;（48）:27-33.
　　［6］Bates CA，Meyer RL.The heavy neurofilament protein is ex-pressed in regenerating adult but not embryonic mammalian op-tic fibers in vitro ［J］.Exp Neurol，1993;（119）:249-257.
　　［7］Thomas PK.The degeneration of unmyelinated axons following nerve section:An ultrastructural study ［J］.J Neurocytol，1974;（30）:497-506.
　　［8］Anthony JW，Josephf P.Neuronal growth factors produced by adult peripheral nerve after injury ［J］.Brain Res，1986;（385）:197-200.
　　［9］Chizuka，Tohyama K，Yokotaet R.Schwann cell basal laminal and nerve regeneration ［J］.Brain Res，1983;（288）:61-75.转贴于