作者：薛晓畅 颜真 石继红 韩苇 张英起
【关键词】 胸腺素α1
关键词: 胸腺素α1 ;串联体;克隆;基因表达;融合蛋白
摘 要:目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1 （thymosin alpha1，Tα1 ）的串联体并进行纯化、鉴定. 方法 将Tα1 的基因拆分为4个片段进行合成，退火后经PCR获得串联体基因，测序正确后克隆在硫氧还蛋白（thioredoxin）融合蛋白表达载体pThioHisA中，转化大肠杆菌TOP10菌株，IPTG诱导表达，表达的融合蛋白经过80℃热处理及阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow进行纯化，Western-blot进行鉴定. 结果 获得了纯化的Thioredoxin-Tα1 ③，分子质量约为31ku. 结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法，Tα1 ③的成功表达为检测其生物学活性奠定了基础.
Keywords:thymosinα1 ;tandem repeat;cloning;gene ex-pression;fusion proteins
Abstract:AIM To express tandem repeat of thymosin alpha1（Tα1 ）with gene engineering method and to purify and iden-tify the fusion protein.METHODS Split Tα1 gene into four fragments，synthesize them respectively and get the tandem repeat gene of Tα1 by annealing and PCR.After sequencing to identify its correctness，clone the gene into fusion expres-sion vector pThioHisA，transforms the E.coli strain TOP10with recombinant plasmid and induces with IPTG.The ex-pressed fusion protein can be purified by heat treatment and Q Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography and i-dentified by western-blot.RESULTS We obtained purifiedThioredoxin-Tα1 ③the molecular weight of which was about31ku.CONCLUSION To express short peptide，the method of expressing tandem repeat gene is practical.The successful expression of Tα1 ③has established a foundation for its biological activity research.
0 引言
1966年Goldstein等［1］ 首次报道了从小牛胸腺中提取的初步具有生物活性的激素样物质，命名为胸腺素.随后的研究表明，它是由动物胸腺上皮细胞分泌的一类多肽和蛋白质激素的总称.胸腺素α1 （thy-mosin alpha1，Tα1 ）是从胸腺素组分5（TF5）中分离纯化出的热稳定酸性多肽［2］ ，由28个氨基酸组成，pI值为4.2，相对分子质量为3108.它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂，已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症［3］ 和免疫缺陷的研究中.虽然Tα1 有着广泛的应用前景，但由于其编码的多肽过短，很难利用基因工程方法实现直接表达，所以目前商用的多是化学合成产品，价格较贵，使其临床应用受到限制.为了探索Tα1 多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达，我们利用随机退火与PCR技术相结合的方法构建了Tα1 的多串体基因，在大肠杆菌中成功地诱导了表达，纯化后获得了Tα1 ③融合蛋白，从而为进一步研究奠定了基础.
1 材料和方法
1.1 材料 pGEM-3zf（-），pThioHisA质粒、DH5α，TOP10菌种由本中心保存，T4多核苷酸激酶、T4DNA连接酶、EcoRI、PstI为TaKaRa产品，Taq DNA聚合酶、DNA分子质量标准购自华美生物工程公司，低相对分子质量标准蛋白质（Mr 14400～97400）购自上海丽珠东风生物技术有限公司，I抗Anti-ThioTM Antibody为Invitrogen产品，II抗为Rabbit anti-Mouse IgG-AP为华美公司产品.Tα1 基因片段及PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成:sequence1（54bp）GACACCAGCAGCGAGATCA CCACCAAGGACCGGAAGGAGAAGAAGGAGG TGGTG;sequence2（30bp）GAGGAGGCCGAG AACAGCGACGCCGCCGTG;sequence3（42bp）CTTGGTGGTGATCTCGCTGCTGGTGTCCAC GGCGGCGTCGCT;sequence4（42bp）GTTCT CGGCCTCCTCCACCACCTCCTTCTTCTCCTTC AGGTC;上游引物（38bp）GGAATTCATGTCT GATGCAGCCGTGGACACCAGCAGCG;下游引物（35bp）GCACTGCAGTCAGTTCTCGGCCTCC TCCACCACCT.
1.2 方法
1.2.1 串联体基因的获得 将Tα1 的氨基酸序列［4］ 按惯用码转化为核苷酸序列，并将其拆分成4个片段合成，合成产物的5’端磷酸化后进行退火，退火产物进行PCR扩增.首先95℃处理5min，加入Taq酶后进行30次循环反应，循环参数为:95℃1min，60℃45s，72℃1min，最后一次延伸反应10min.
1.2.2 PCR产物的克隆、酶切和序列鉴定 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切取目的条带，用试剂盒进行纯化回收，经EcoRI和PstI酶切后与克隆载体pGEM-3zf（-）连接，连接产物转化E.coli DH5α，挑取候选克隆酶切鉴定插入片段大小并进行测序.将测序正确的序列与硫氧还蛋白融合表达载体pThio-HisA进行连接，转化E.coli TOP10，筛选阳性克隆进行诱导表达.
1.2.3 胸腺素α1 ③的表达 将酶切鉴定的阳性克隆菌种接种入含氨苄青霉素100mg・L-1 的LB培养液中，37℃震荡培养过夜，以1∶100转接，继续培养3h（A600nm =0.5），将菌液分装入两个试管中，其中一管作为诱导的阴性对照，而另一管加入异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG），终浓度0.5mmol・L-1 ，继续培养4.5h，离心（12000g，2min）收菌，取样进行SDS-PAGE鉴定，IPTG诱导者与未诱导者相比，在相对分子质量31×103 处有一条明显的深染新生蛋白带，与理论计算的融合蛋白相对分子质量大小相符.
1.2.4 重组Tα1 的纯化及蛋白免疫印迹鉴定 在三角摇瓶中扩大Tα1 ③表达，收菌后称重湿菌体，按200g・L-1 的量加入20mmol・L-1 Tris，然后用高压破菌法将菌体进行裂解，裂解的过程中加入适量的DNaseI和EDTA（终浓度0.5mmol・L-1 ）.80℃热处理［5］ 10min，其间要不断振摇.处理完后迅速进行冰浴，使裂解液冷却，离心（12000g，15min），上清透析后过Q-sepharose Fast Flow阴离子柱，可获得高纯度的Tα1 ③融合蛋白. 蛋白质免疫印迹按常规方法进行，纯化的Tα1 ③融合蛋白行SDS-PAGE，并转移至NC膜上，NC膜经20g・L-1 BSA封闭后与Thioredoxin单抗进行反应，经酶标二抗及显色获得阳性结果.
2 结果
2.1 PCR及酶切和序列鉴定 Tα1 的基因合成片段经随机退火后进行PCR反应，扩增产物经20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，可得到大小不同的许多条带，约呈一间隔90bp的梯度.回收特定大小的片段，酶切后与pGEM-3zf（-）克隆质粒进行连接，转化DH5α菌株后筛选阳性克隆.共获得6个阳性克隆，经EcoRI和PstI酶切后，有大小不同的2种插入片段，小片段190bp左右，大片段270bp左右，经测序后分别为序列正确的Tα1 的三串体和二串体基因，还含有起始码、终止码序列及酶切位点（测序资料略）（Fig1）.
图1 略
2.2 Thioredoxin┐Tα1 ③融合蛋白的表达与纯化 将目的片段连入表达载体.经酶切鉴定的阳性菌株，在IPTG诱导下，能稳定表达Tα1 ③融合蛋白，表达蛋白在菌体总蛋白中的含量为250g・kg-1 ，相对分子质量约为31×103 ，与理论计算值相符.
大量诱导阳性表达菌，表达蛋白以可溶性形式存在，经热处理及离子交换层析可获得纯化的Tα1 ③融合蛋白（Fig2）.
2.3 蛋白质免疫印迹鉴定Thioredoxin┐Tα1 ③融合蛋白 纯化的融合蛋白经120g・L-1 SDS-PAGE后，转移到NC膜，以小鼠抗PH-Thioredoxin为一抗，兔抗鼠抗体为二抗，碱性磷酸酶显色，检测其反应特异性.结果表明:融合蛋白与单抗有特异结合能力（Fig3）.
图2 － 图3 略
3 讨论
Tα1 是从胸腺素组分5（TF5）中分离纯化出的热稳定酸性多肽，具有极其多样的功能.对T［6］ ，B，NK
［7］ 等细胞具有调节作用，可以增强机体免疫力，参与胸腺细胞凋亡的调节［8］ ，在抗病毒［9，10］ 、真菌［11］ 方面也有作用，还与男女不育、艾滋病、心血管疾病等［12，13］ 有着密切的关系，此外在神经系统［14，15］ 中也有作用.由于其广泛的应用价值，20世纪90年代初在美国进入Ⅲ期临床.但是，目前多为化学合成产品，价格比较昂贵，应用的推广受到限制.
此前，我们已经对Tα1 的单体进行了表达，并证明有活性，但是其不易纯化、得率较低，电泳也需用小 分子肽电泳［16］ ，难以获得理想的结果.同时也为了探讨Tα1 多聚体可能的生物学活性，我们拟采取串联的思路对其在大肠杆菌中进行表达.起始时，我们期望通过合成片段的随机退火获得含有不同单体数目的串联体.但是由于其基因序列比较特殊，而且GC含量大，正确退火产物量很少，所以靠随机退火较难成功构建串联体基因.如果直接合成二串体，然后用单酶切进行串联，由于插入的方向性不确定，导致了工作量尤其是后期鉴定的工作量也会很大.
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