【关键词】 单链抗体
关键词: 单链抗体;肿瘤坏死因子;绿色荧光蛋白;基因表达
0 引言
肝癌恶性程度极高，在我国有着较高发病率和死亡率，迄今尚无理想的治疗手段.随着现代分子生物学和免疫学的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望，尤其是单链抗体的应用成为肿瘤免疫基因治疗的热点.
我们利用本室克隆的抗肝癌单链抗体（sFv）基因与人肿瘤坏死因子（TNF-α）基因偶连，构建抗肝癌单链双功能抗体与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合表达的真核表达载体，并在小鼠成纤维细胞NIH3T3中表达了sFv-TNF-GFP融合蛋白，为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.
1 材料和方法
1.1 材料 pEGFP-N3质粒（内含GFP基因）由赵利军博士惠赠，抗肝癌sFv基因为本室构建，TNF-α基因由孙志伟博士惠赠.大肠杆菌JM109，pGEM-T载体和磷酸钙转染试剂盒购自Promega公司.限制性内切酶、T4DNA连接酶、X-gal及IPTG购自Gibco公司.PCR引物由上海生物工程公司合成.
1.2 sFv和TNF-α基因的扩增和克隆 以pGEX-sFv为模板，用含引导肽序列和内切酶位点（EcoRⅠ，SalⅠ）的引物扩增出sFv片段，以PET-TNF-α为模板，用含SalⅠ和SacⅡ位点的引物扩增出TNF-α基因.PCR产物纯化后分别连入pGEM-T载体，转化JM109感受态细菌，经蓝白筛选挑出阳性克隆，酶切鉴定并测序，分别命名为pGEM-sFv和pGEM-TNF.
1.3 双功能抗体基因与GFP基因融合表达载体的构建和鉴定 pGEM-TNF质粒用SalⅠ和SacⅡ双酶切，回收TNF-α片段，与经SalⅠ和SacⅡ消化的pEGFP-N3载体连接，酶切鉴定挑出重组体，命名为pEGFP-TNF.用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pGEM-sFv质粒，回收sFv片段，定向克隆入pEGFP-TNF的TNF-α5’端，酶切鉴定重组体，命名为pEGFP-ST，即为单链双功能抗体和GFP融合表达的真核表达载体.
1.4 双功能抗体-GFP融合蛋白的真核表达 以标准的磷酸钙共沉淀法将pEGFP-ST转染NIH3T3细胞，转染后20h于倒置荧光显微镜下观察活细胞中GFP融合蛋白的表达.
2 结果
2.1 融合蛋白表达载体的构建和鉴定结果 分别克隆sFv及TNF-α到pGEM-T载体，经测序证实所克隆的片段分别与已知基因序列一致.定向克隆的pEGFP-ST经EcoRⅠ，SalⅠ双酶切下790bp左右的sFv片段，SalⅠ，SacⅡ双酶切下470bp左右的TNF-α片段，EcoRI，SacⅡ双酶切下1260bp左右的sFv-TNF-α片段（图1）. 转贴于 图1 略
2.2 细胞内融合蛋白表达结果 转染后20h倒置荧光显微镜下即可观察到经pEGFP-ST转染的部分细胞发出较强的绿色荧光，散在或成对出现，阳性细胞约为50%.连续观察发光细胞逐渐增多，约72h达最高，有灶性发光细胞出现.
3 讨论
双功能抗体是近几年发展起来的一类基因工程抗体，将抗体基因与一种或几种具有其他生物活性的效应分子（如毒素分子，细胞因子等）基因相连并融合表达，这种融合表达的蛋白不仅具有与抗原特异性结合活性，而且具有效应分子的特殊功能.1989年Chaudhary等［1］ 先将抗卵巢癌的sFv与去除受体结合区的假单孢杆菌外毒素（PE40）基因融合表达单链免疫毒素，使荷瘤裸鼠体内的移植瘤完全消失.目前已有多种单链免疫毒素基因治疗计划进入临床试验.但由于 毒素均来源于细菌，且分子量通常较大，具有较强的免疫原性，因而在临床应用中受到一定的限制.
以细胞因子为效应分子的双功能抗体报道极少.常用的细胞因子有IL-2，TNF-α，IFN等.1991年Hoogenboom等［2］ 首次构建了抗体-TNF-α融合蛋白，将人TNF-α基因融合于肿瘤特异性人-鼠嵌合抗体Ch3或CH3下游，并在骨髓瘤细胞中表达，对肿瘤细胞具有杀伤活性，但因分子量大仍可被人体的免疫系统识别并产生人抗鼠抗体（HAMA），限制了它的重复使用.
单链抗体是由Fv抗体衍生而来的一类无Fc段的小分子抗体，其最大特点是分子量小、穿透力强、容易进入实体瘤周围的血液循环［3］ .同时由于免疫原性低，人体可以重复使用，目前尚未见人体试用产生HAMA报道，因而具有巨大的临床应用潜力.
为构建分子量尽可能小、免疫原性尽可能弱的双功能抗体，我们在人TNF-α基因前融合了抗肝癌sFv基因，并将该双功能抗体基因克隆入带有GFP基因的真核表达载体中.GFP来源于水母Aequorea victoria，由238个氨基酸组成，分子质量27ku，紫外线激发可产生明亮、稳定的绿色荧光，其无种系依赖性，且对宿主细胞无毒性，目前已作为一种新型的报告分子广泛应用于生命科学的众多领域，尤其在基因表达和定位等方面更具优越性［4］ .我们构建了抗肝癌单链双功能抗体融合GFP表达载体，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，为肝癌的免疫基因治疗提供了一种灵敏、直观、有效的研究手段.
参考文献
［1］Chaudhary VK，Queen C，Junghans RP，Waldmann TA，Fitz Gerald DJ，Pastan I.A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to pseudomonas exotoxin ［J］.Nature，1989;339（6223）:394-397.
［2］Hoogenboom HR，Raus JC，Volckaert G.Construction and ex-pression of antibody-tumor necrosis factor fusion protein ［J］.Mol Immunol，1991;28（9）:1027-1037.
［3］Yokota T，Milinic DE，Whitlow M，Shlom J.Rapid tumor pen-etration of a single chain Fv and comparison with other im-munoglobulin forms ［J］.Cancer Res，1992;52（12）:3402-3408.
［4］贺竹梅，李华平，李宝健，李志芳，黄定华.绿色荧光蛋白在生命科学研究中的应用［J］.遗传，1998;20（5）:43-46.