【关键词】 苦参碱;K562细胞
关键词: 苦参碱;K562细胞;bcl-6;凋亡;PCNA
0 引言
自20世纪80年代即发现苦参碱具有抗鼠肿瘤的活性［1］ .最近，有人发现它能抑制人红白血病K562细胞增殖［2］ ，未见有关引起细胞凋亡及其机制的报道.我们研究发现，苦参碱可诱导K562细胞凋亡相关基因bcl-6表达上调、增殖细胞核抗原（PCNA）表达受抑.
1 材料和方法
1.1 细胞培养 人红白血病细胞株K562接种于含100mL・L-1 胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、饱和湿度、50mL・L-1 CO2 孵箱内培养，3d换液、传代1次.
1.2 药品和试剂 苦参碱（matrine）购自西安市天其植物化学药品公司（纯度&>0.98，相对分子质量248.36）.抗Bcl-6，PCNA单克隆抗体购自DAKO公司，Western blot检测试剂盒购自德国BOEHRINGER MANNHEIM公司.
1.3 苦参碱诱导K562细胞实验 将处于对数增长期K562细胞分为7组，分别接种于100mL培养瓶内培养（每组105 个），1组为空白对照，另6组细胞分别加入0.05，0.1，0.2，0.4和0.5g・L-1 苦参碱诱导，每日观察细胞形态，并行细胞计数.诱导第7日提取各组细胞总蛋白，于-20℃保存备用.
1.4 Bcl-6，PCNA检测及凋亡细胞电镜观察 将对照组及0.2g・L-1 苦参碱诱导组细胞总蛋白提取液定量为1g・L-1 ，各取样品10μL，采用Western blot试剂盒检测，按说明操作.对照组及苦参碱诱导组细胞制作常规超薄切片，电子染色，EM-2000EX电镜观察.
2 结果
2.1 不同浓度苦参碱抗K562细胞增殖作用 苦参碱诱导K562细胞48h后，0.1g・L1 以上浓度组细胞均显示出增生明显受抑（P&<0.01），细胞数与苦参碱浓度呈负相关（r=-0.965），0.4g・L-1 和0.5g・L-1 组细胞于第5～7日呈负增长.0.2g・L-1 浓度组出现部分细胞呈葡萄串样聚集，少数细胞膨出圆形小泡.当浓度大于或等于0.3g・L-1 时，上述现象更为明显.
2.2 Western blot检测Bcl-6及PCNA结果 Western blot检测显示，对照组Bcl-6阴性，PCNA呈阳性;0.2g・L-1 浓度苦参碱诱导K562细胞后，Bcl-6阳性，而PCNA检测结果阴性（图1）.
2.3 苦参碱诱导K562细胞凋亡的电镜观察 电镜下见细胞染色质浓集靠边，呈月芽状，一些细胞核染色质和胞膜向细胞外突起，部分脱落形成凋亡小体（图2）. 3 讨论
苦参碱是从豆科槐属植物苦豆子、苦参根中分离得到的生物碱，因其具有抗炎、抗肿瘤及抗心律失常等生物学活性而受到关注［1］ .我们通过对对照组K562细胞及苦参碱诱导组K562细胞进行计数，一般形态学观察及Western blot检测PCNA及Bcl-6蛋白的表达情况，显示苦参碱对K562细胞增殖有显著抑制作用，其抗增殖活性与其浓度呈正相关.PC-NA是DNA聚合酶辅因子，其表达与细胞增殖密切相关［3］ .对照组细胞PCNA检测阳性，而苦参碱诱导组为阴性，提示PCNA表达受抑可能是苦参碱抗K562细胞增殖的机制之一.Bcl-6是位于3q27的原癌基因，其产物Bcl-6过表达可引起细胞凋亡［4］ .Western blot检测Bcl-6结果显示，0.2g・L-1 苦参碱诱导K562细胞后，使Bcl-6表达上调，光镜和电镜观察细胞出现凋亡的特征性形态改变，说明苦参碱可诱导Bcl-6表达上调，而过表达的Bcl-6可能参与了促使K562细胞凋亡的分子基础.我们的研究表明苦参碱有望成为一种新的有效的白血病细胞凋亡诱导剂.
图1 略
图2 略
参考文献
［1］陶上乘，王静珍.苦豆子生物碱的药理作用［J］.中国药学杂志，1992;27:201-204.
［2］张莉萍，蒋纪恺，张 彦et al.苦参碱对K562细胞增殖与分化作用的机制研究［J］.中华血液学杂志，1999;20（6）:315-316.
［3］Pich A，Ponti R，Valerte G et al.MIB-1，Ki67，and PCNA scores and DNA flow cytometry in intermediate grade madignant lymphomas ［J］.J Clin Pathol，1994;47:18-22.
［4］Albagli O，Lantoine D，Quief S et al.Overexpressed Bcl-6（LAZ3）oncoprotein triggers apoptosis，delays S phase progres-sion and associates with replication foci ［J］.Oncogene，1999;18:5063-5075.