【关键词】 骨质疏松
关键词: 骨质疏松;骨折;转化生长因子β;核酸杂交
摘 要:目的 探讨Ⅰ型骨质疏松骨折愈合的病生机制，检测骨质疏松性骨折愈合过程中TGF-β1 mRNA的基因表达模式及细胞定位. 方法 利用去势SD大鼠造成Ⅰ型骨质疏松及其骨折模型，通过原位杂交、斑点杂交检测骨痂局部TGF-β1 mRNA的表达. 结果 骨质疏松骨折与正常骨折愈合过程中TGF-β1 mRNA基因表达的细胞定位未见差别;TGF-β1 mRNA表达的变化模式与正常骨折愈合过程相似. 结论 TGF-β1基因表达的改变与骨质疏松骨折愈合的病生改变未见关联.
Keywords:osteoporosis;fractures;transforming growth fac-tor beta;nucleic acid hybridization
Abstract:AIM To assess the changes of gene expression of the transform growth factors-β1 in the process of the healing of the osteoporotic fracture in ovariectomized female SD rats.METHODS Ovariectomized female SD rats were used as model of type I osteoporosis and osteoporotic fracture and the changes of gene expression of the transforming growth fac-tors-β1 were detected in the process of the healing of the os-teoporotic fracture through in situ and blot hybridization.RESULTS There was no difference of the cellular localiza-tion in TGF-β1 expression between the processes of the nor-mal and osteoporotic bone healing by in situ hybridization;The pattern of the gene expression of TGF-β1 mRNA was similar to the normal in the process of the osteoporotic bone healing by dot blot hybridization.CONCLUSION Expres-sion of TGF-β1 mRNA is not related to the pathophysiological changes in the process of osteoporotic bone healing.
0 引言
转化生长因子β（TGF-β）是骨组织中含量最丰富的细胞生长因子之一［1］ ，它既具有促进成骨细胞分化增殖，刺激骨形成，又具有支持破骨细胞形成，刺激骨吸收的双重作用，是骨形成与骨吸收之间重要的偶联调节因子［2，3］ .另外，TGF-β在骨折愈合过程的不同时期具有促进细胞分化，诱导骨、软骨形成及钙化等作用［4-6］ .我们利用去势SD雌性大鼠作为Ⅰ型骨质疏松及其骨折模型，通过原位杂交、斑点杂交，对骨质疏松性骨折骨痂局部TGF-β1 mRNA基因表达的细胞定位和表达模式进行了研究，这有助于从基因表达水平深入了解骨质疏松骨折愈合的病生机制.
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立 所有实验动物选用纯种Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠，体质量在250～450g（本校实验动物中心提供），鼠龄6～9mo，共120只，随机分为骨质疏松组（OVX）及假手术对照组（Sham），每组随机分为骨折组及非骨折对照组;骨折组以骨折后1，4，9，13及28d又各分为5组，每组均10只.10g L-1 戊巴比妥钠（40mg kg-1 ）ip麻醉下经背侧切口，OVX组行双则卵巢切除术，Sham手术组做双侧卵巢暴露，即关闭切口.术后2mo，骨折组动物ip麻醉下先用0.5mm齿科钢丝行胫骨髓腔内固定术，后用专用大鼠骨折器，于大鼠双侧胫骨中段造成闭合性骨折.分别于1，4，9，13及28d时间段无菌条件下取材，一侧标本多聚甲醛固定、复合脱钙液脱钙、石蜡包埋，0.5μm切片用于原位杂交;另侧标本直接放入液氮冷冻保存，用于总RNA提取.取材范围包括两骨折端及其间组织.
1.2 原位杂交 TGF-β1 cDNA探针购于北京医科大学免疫教研室，探针标记按地高辛标记及检测试剂盒（宝灵曼公司）说明进行.组织切片脱蜡，0.2mol L-1 盐酸处理5min，蛋白酶K（10mg μL-1 ）消化10min，杂交探针浓度为300～50ng mL-1 ，42℃恒温杂交10～16h.1 5000封闭液稀释酶标地高辛抗体2h，显色10min，蒸溜水冲洗2min，封片镜检.
1.3 总RNA的提取 组织块质量（1g），捣碎加盐酸胍组织裂解液10mL，加5mL L-1 十二烷基肌氨酸钠匀浆1min，离心收上清入新管，加入0.1体积3mol L-1 醋酸钠，加等体积水平衡酚及0.2体积氯仿异戊醇，12000r min-1 离心10min，加入0.6体积异丙醇10min，12000r min-1 离心10min，700mL L-1 乙醇洗涤真空抽干，100μL DEPC水溶解，取6μL加水至600μL，紫外分光光度计测定RNA含量.
图1 －图6 略
1.4 斑点杂交 硝酸纤维素膜8cm×10cm两张，铺膜于真空抽吸打点仪上，加等体积RNA变性液于RNA液中（RNA浓度1g L-1 ）变性1h，点膜，每一标本样品为一个点，每点总RNA量为4μg，室温干燥，80℃干烤2h，冷却至室温，将2张硝酸纤维素膜分别装入塑料袋，倒入预杂交液10mL，42℃预杂交16h，按浓度15～60μg L-1 加入变性的Dig标记TGF-β1 cDNA探针，42℃杂交20h，1 5000封闭液稀释酶标地高辛抗体10mL孵育30min，显色液中显色16h，薄层扫描仪扫描半定量测定.
1.5 实验对照 正常对照:采用正常及骨质疏松非骨折组动物的胫骨及其周围软组织切片进行杂交反应;空白对照:采用未加探针杂交液进行杂交反应.
统计学处理:骨折组同一时间点组间数据及同组不同时间点数据通过SPSS统计软件进行方差分析（ANOVA），非骨折组OVX与Sham组间数据进行均数t检验.
2 结果
2.1 原位杂交结果 正常骨折与骨质疏松性骨折愈合过程中TGF-β1 mRNA基因表达的细胞定位无差别，且表达模式基本相似.TGF-β1 mRNA主要定位于软骨细胞、成骨细胞以及间充质细胞.急性创伤反应期:TGF-β1 mRNA未见表达（Fig1）;骨膜下成骨期:TGF-β1 mRNA在骨膜下的成骨细胞内均有表达（Fig2）;软骨形成期:软骨细胞、成骨细胞内TGF-β1 mRNA均有表达（Fig3）;软骨钙化期:TGF-β1 mR-NA在钙化前缘两侧的软骨细胞和成骨细胞内均有表达，且呈高表达（Fig4）.
2.2 斑点杂交结果 正常及骨质疏松骨折愈合的斑点杂交结果分别见Fig5，6.根据薄层扫描仪扫描所得光密度值（A）（x ±s），每个样本mRNA含量按如下公式计算:每个样本mRNA含量=斑点光密度值×每个样本mRNA总量（μg），见Tab1.
3 讨论
TGF-β1 在正常骨折愈合中的调节作用已有相关研究，Joyce等［7］ 的研究发现，在大鼠胫骨骨折愈合的第一阶段，TGF-β1 主要来源于血小板的脱颗粒作用，并认为是启动骨折愈合过程的关键细胞因子之一.第二阶段，主要定位于间充质细胞和膜内成骨中的成骨细胞;在第三阶段，主要定位于间充质细胞、幼稚及成熟的软骨细胞;在第四阶段，仅在靠近钙化前缘的肥大软骨细胞中有TGF-β1 mRNA少量表达.Noth-ern bloting检测证明在骨折后第13日TGF-β1 mR-NA的表达量达到高峰.我们的实验提示，正常骨折愈合过程中，在不同时间点，TGF-β1 mRNA的表达高峰在第13日，且与1，4及28d相比有显著性差异（P&<0.05），其表达模式与Joyce等的实验结果相符合.有关骨质疏松性骨折愈合过程中相关细胞因子改变的研究资料较少.现已知:TGF-β1 对骨形成和骨吸收具有双向作用;实验表明［8］ ，无论骨源性或血小板源性TGF-β均可双向性地刺激胎鼠颅骨及胎牛骨成骨细胞系DNA的合成，其合成率随TGF-β的增加而出现上升、峰值、下降三个过程.且这种反应与细胞的分化程度关系密切，即分化程度越高，反应越差.骨膜下注射TGF-β既可刺激膜内成骨，又可刺激软骨内成骨［9］ .TGF-β除具有促进骨形成的作用外，尚具有刺激骨吸收的作用.有实验表明，TGF-β1 可以自分泌机制刺激人类白血病细胞系向破骨样细胞的分化，且这种作用可被TGF-β1 抗体所抑制.我们的实验提示，在骨质疏松性骨折愈合过程中TGF-β1 mRNA在表达模式上与正常组均相似，同一时间点其表达量的均数与正常骨折组相比均高，但统计学上无显著性差异.不同时间点，其峰值也出现在骨折后第13日，且与第1，4，28日有显著性差异（P&<0.05）.由于骨折后第13日正处于骨折愈合的软骨成熟及软骨内钙化期［11］ ，TGF-β1 的高表达是否与软骨钙化期的出现相关，尚需进一步的研究证实.TGF-β1 的基因表达无论从细胞定位或表达量方面，与正常组相比则无明显改变，提示TGF-β1 与Ⅰ型骨质疏松骨折愈合过程中的病生改变无关联.
参考文献
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