关于中药佳蓉片与雌激素对生殖系统作用的异同

作者：陈亚琼，杨海燕，黄艳红，吴曙光，叶雪清

【关键词】 中成药
　　关键词: 中成药;卵巢切除术;子宫;小鼠;阴道
　　
　　摘 要:目的 观察复方中药佳蓉片（JRP）与乙烯雌酚（DES）对生殖系统的不同作用. 方法 用JRP低（JRP-L，6g kg-1 ）、JRP中（JRP-M，12g kg-1 ）、JRP高（JRP-H，24g kg-1 ）三个不同剂量、DES（0.17mg kg-1 ）和生理盐水（Con-trol0.5mL）每日分别灌胃处理70只未成年（17d）昆明小鼠3d和50只去卵巢成年（60d）昆明小鼠28d，成年小鼠实验中另设灌服生理盐水的假去卵巢组（Sham）和去卵巢组（OVX），观察对子宫质量/体质量百分比（PUM）、阴道上皮细胞角化百分比（VKEC）、血清17β雌二素（E2）水平的变化. 结果 （1）PUM值JRP不同剂量处理未成年小鼠3d后，JRP-M组的PUM值高于Control组（12.52.3，vs8.21.4，P&<0.01），但明显低于DES组（37.03.8，P&<0.01）.JRP处理成年去卵巢小鼠28d后，OVX+JRP三个组的PUM值显著高于OVX组（分别为10.91.9，11.33.3，14.67.8，vs8.41.4，P&<0.05），但明显低于OVX+DES组（29.511.7，P&<0.01）和Sham组（33.612.1P&<0.01）;（2）VKEC值OVX+JRP三个不同剂量组的VKEC值与OVX比较明显增加（分别为7.12.5，11.03.5，9.45.4，vs1.80.8，P&<0.05），但增加值显著低于DES组（5.71.4，P&<0.05）;（3）血清E2值OVX+JRP组和OVX+DES组的血清E2水平与OVX组比较无差异. 结论 JRP对小鼠子宫、阴道有弱雌激素样作用，但作用强度远低于DES，这种作用可能不是通过提高内源性E2水平而实现的.
　　

　　Keywords:Chinese patent drugs;ovariectomy;uterus;mice;vagina
　　
　　Abstract:AIM The investigated was designed to evaluate the different effects of diethylstilbestrol（DES）synthesized estrogen and Jiarongpian（JRP）made from traditional Chi-nese herbal medicines of tonifing the kidney，on reproductive system in female mature ovaritectomized（OVX）and imma-ture Kunming mice.METHODS Fifty Kunming female im-mature（17d old）mice were piding into five groups:JRP lower dosage（JRP-L，6g kg-1 d-1 ），JRP mediun dosage（JRP-M，12g kg-1 d-1 ），JRP higher dosage（JRP-H，24g kg-1 d-1 ），DES（0.17mg kg-1 d-1 ）and Control（normal saline NS，0.5mL d-1 ），and were fed o.5mL solution in-cluding JRP，DES or normal saline for3d.All immature mice were sacrificed to examine the percentage of uterine mass（PUM）.Sixty Kunming mature（60d old）female mice were pided into six groups:Sham operated（Sham，NS0.5mL d-1 ）;OVX（NS0.5mL d-1 ）;OVX+JRP-L（6g kg-1 d-1 ），OVX+JRP-M（12g kg-1 d-1 ），OVX+JRP-H（24g kg-1 d-1 ），OVX+DES（0.17mg kg-1 d），and all mature mice were fed0.5mL solution of JRP，DES or NS beginning3d after surgery for28d.All of the animals were sacrificed to measure the percentage of uterine mass（PUM），vaginal keratinized epithelial cells（VKEC），and serum E2level.RESULTS ①PUM of OVX+JRP-M group in imma-ture mice was significantly increased than in control group（12.52.3，vs8.21.4，P&<0.05），but it far from lesser than DES group（12.52.3，vs37.03.8，P&<0.01）.The PUM of OVX+JRP-L，JRP-M，JRP-H groups in mature mice were significantly higher than in OVX group（10.91.9，11.33.3，14.67.8，vs8.41.4，P&<0.05），P&<0.01，respectively），but they were less markedly than that in DES group（29.511.7，P&<0.01）and Sham group（33.612.1，P&<0.01）;②The VKEC of OVX+JRP-L，JRP-M，JRP-H groups in ma-ture mice were increased significantly than in OVX group（7.12.5，11.03.5，9.45.4vs1.80.8，P&<0.05，respec-tively），but they less than that in DES group（P&<0.01）.③The serum E2levels were similar in OVX+JRP-L，JRP-M，JRP-H groups and OVX+DES.CONCLUSION Jiarongpi-an，a kidney tonify recipes made from traditional Chinese medicine，may play a weakly estrogen-like role on reproduc-tive system in mature OVX or immature female Kunming mice，but the effect was significantly less than estrogen.
　　
　　0 引言
　　
　　激素替代治疗在治疗更年期综合征，预防绝经后骨质疏松和心血管疾病等方面有很好的疗效，但用药后患者阴道不规则出血、增加患子宫内膜癌和乳腺癌的危险等副作用，使激素替代治疗的可接受性较差［1-3］ .研究发现中药佳蓉片（JRP）对治疗更年期综合征，防治骨质疏松等疾患有很好的疗效，其临床效果与雌激素相似［4，5］ .但JRP是否也具有雌激素样的作用，特别是对生殖系统的副作用值得研究.我们通过观察药物对未成年和成年卵巢摘除小鼠子宫体质量百分比、阴道细胞涂片和血清雌激素等变化，比较了JRP与合成雌激素乙烯雌酚（diethyl-stilbestrol，DES）对生殖器官的雌激素样作用.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 实验药品
　　DES（diethylstilbestrol）购自Sigma公司.JRP（由西安博爱制药厂提供）每片含生药1.0g，临用前用生理盐水配制成所需浓度的混悬液.
　　
　　1.2 动物饲养条件
　　雌性昆明小鼠购于本校实验动物中心，饲养温度22℃，12h光照，12h黑暗，容许自由饮水及摄食.未成年雌性昆明小鼠70只，出生后17d，体质量（15±2）g.随机分为7组，每组10只，立即开始实验.成年雌性昆明小鼠50只，出生后60d，体质量（37±2）g，随机分为5组，每组10只，适应性饲养5d后开始实验.
　　
　　1.3 未成年雌性小鼠实验
　　分组及用药剂量:对照组（control，生理盐水0.5mL d-1 ），DES组（0.17mg kg-1 ），JRP组根据剂量又分为JRP-L（6g kg-1 ），JRP-M（12g kg-1 ），JRP-H（24g kg
　　 -1 ）等3个组，共处理3d.
　　
　　1.4 成年雌性小鼠实验
　　1.4.1 模型复制及分组处理
　　①模型复制:全部动物在戊巴比妥钠（10g L-1 ）麻醉下行手术.假手术组仅在开腹后去除卵巢周围的脂肪组织后关腹;其余各组去除双侧卵巢.术后连续观察阴道涂片4d，去卵巢后小鼠表现为动情间期表现，证实手术成功;②分组处理:根据每日药物处理剂量分为4组:OVX组（生理盐水0.5mL d-1 ），假手术组（Sham，生理盐水0.5mL d-1 ），OVX+DES组（0.17mg kg-1 ）和OVX+JRP组.JRP根据处理剂量不同又分为JRP-L（6g kg-1 ）、JRP-M（12g kg-1 ）、JRP-H（24g kg-1 ）等3组.术后第5d开始药物灌胃，每只0.5mL，每日1次，连续28d.
　　
　　1.4.2 阴道细胞涂片
　　成年小鼠灌胃第14日开始进行阴道涂片观察:以左手背位固定小鼠，右手取一预先吸有生理盐水0.1～0.2mL的钝头吸管，小心插入小鼠阴道内2～3cm反复抽吸2～3次，吸出1滴液体于载玻片上，均匀涂开，放入950mL L-1 乙醇中固定15min，取出晾干，用伊红（5g L-1 ）染色，显微镜下观察并记数阴道上皮角化细胞（VKEC）百分率，每日涂片1次，连续观察7d.
　　
　　1.5 动物处理
　　未成年和成年小鼠均在最后一次喂药后24h称体质量，眼球取血0.8mL，然后以颈椎脱臼处死动物，剖腹取出子宫，迅速用电子天平称子宫湿质量，计算子宫质量百分比（PUM，%）.成年小鼠的血清17β雌二醇水平（E2）用放射免疫法测定.统计学方法:数据采用x ±s表示，用t检验比较组间差异. 转贴于 　　2 结果
　　
　　2.1 JRP对未成熟小鼠体质量和子宫湿质量的影响
　　与对照组比较，未成年雌性小鼠在JRP3个不同剂量组灌胃处理3d后，体质量增加值和子宫湿质量与对照组比较有显著差异（P&<0.01），但增加值显著低于DES组（P&<0.01）.JRP-M组处理3d后，小鼠体质量和子宫湿质量较其它各JRP组增加明显（P&<0.01，Tab1）. 表1 佳蓉片和雌激素对未成熟雌性小鼠子宫及体质量的影响（略）
　　
　　2.2 JRP对成年去卵巢小鼠的影响
　　去卵巢4wk后，OVX组的PUM明显低于Sham组（P&<0.01）;DES组的PUM与Sham组无显著差异;与OVX对照组比较，JRP-L，JRP-M，JRP-H3个组的PUM增加（P&<0.05），但显著低于Sham组与OVX+DES组（P&<0.05）.小鼠去卵巢后，阴道细胞学检查无动情周期的变化，角化细胞数量极少;OVX+DES的角化细胞数量显著上升，与OVX对照组有显著的差异（P&<0.05）;JRP各组的阴道角化细胞数量与OVX组相比较有显著性增加，但远低于OVX+DES组.OVX小鼠血清雌激素水平降低，与Sham组有显著差异（P&<0.01），JRP-L，JRP-M，JRP-H和OVX+DES与OVX组的血清E2水平相似（Tab2）.表2 佳蓉片对去卵巢小鼠子宫质量百分比、阴道角化上皮细胞、血清E2水平的影响（略）
　　3 讨论
　　
　　更年期综合征和绝经相关疾病的发生与更年期妇女卵巢功能低下、雌激素水平降低密切相关.随着人口老龄化社会的到来，更年期综合征及相关疾病的患者越来越多，由此而引起的家庭和社会双重负担日益加重.目前，激素替代治疗是防治绝经期综合征及绝经相关疾病的主要措施，但长期应用有增加子宫内膜癌和乳腺癌发病率的危险，使绝经后妇女对应用激素替代治疗的顺从性不高［6-10］ .因此，寻求 副作用小的更有效的治疗方法具有十分重要的意义.我们多年的临床实践和基础研究证明，主要成分为倒卵五叶加、熟地黄、菟丝子、肉苁蓉、女贞子补肾中药复方JRP具有补肾、滋阴壮阳和扶正固本的功效，对更年期综合征及绝经后骨质疏松等有很好的疗效，临床效果与雌激素类似［4，5］ .现代研究表明，部分植物药材中包含一类具有雌激素活性的化学物质，统称为植物雌激素（phytoestrogens），它们的结构可能与雌激素相似，可能存在与雌激素受体结合的基团，也可能以其他方式与机体作用而表现为雌激素样效应［11，12］ .植物雌激素有防治绝经期综合征，绝经后骨质疏松的功效［7-11］ ，而无刺激子宫内膜和乳腺增生的副作用.有学者［13-15］ 提出植物雌激素可作为激素替代治疗的选择之一.植物雌激素的深入研究为补肾中药防治绝经相关疾病提供了强有力的证据.有关JRP作用机制的研究也表明，JRP对神经递质和性腺轴激素的调节作用［4，5］ 与雌激素作用类似.因此，证实JRP是否具有雌激素样作用及对生殖系统的副作用是本实验的重点研究内容.
　　
　　未成熟雌性小鼠是公认的研究外源性雌激素对生殖器官作用的理想模型，采用子宫湿质量与体质量之比的百分数作为评价雌激素活性指标.该法简便快速，灵敏度高，植物药中的多种化学结构经体内转化后才有雌激素活性的物质和中间代谢产物特别适用于本方法检测.本实验中，用合成雌激素DES处理未成熟小鼠3d后体质量和子宫湿质量显著增加，子宫体质量百分比值升高，证实了本模型的可靠性.JRP3个不同剂量组处理未成年小鼠3d后，子宫体和体质量显著高于对照组.使去卵巢小鼠子宫体质量百分比值显著增加，并成剂量依赖性关系.结果提示中药JRP有促进机体合成代谢和弱雌激素样作用.去卵巢小鼠的阴道细胞涂片可作为检测植物雌激素活性的敏感指标.有正常动情周期的小鼠摘除卵巢后，阴道上皮角化细胞率明显减少至1.8%，而用DES后阴道上皮细胞率值达到95.7%.在本实验中，JRP3个剂量组的阴道细胞涂片中角化细胞数量明显高于对照组，但远远低于DES组对阴道上皮细胞的影响，JRP的作用仅为DES的九分之一.血清雌激素水平测定发现，去卵巢小鼠雌激素水平低落，用JRP后雌激素水平无明显变化，间接提示JRP弱雌激素样作用并不是通过提高内源性雌激素水平而实现的.近年来的研究提示部分中药，包括佳蓉片组方中的中药含有植物雌激素，JRP的弱雌激素样活性有可能是JRP组方中的植物雌激素发挥的作用，这也为JRP治疗更年期综合征，绝经后骨质疏松等疾病，提供了药理学证据.中药的药理作用表现为多靶点、多途径的综合效应，这与中药，特别是中药复方中含有众多的化学物质有关.我们的研究仅从一个侧面，一个角度探讨了JRP与雌激素作用的差异，补肾中药的复杂作用机理还有待于进一步研究.
　　参考文献:
　　
　　［1］Grady D，Rubin SM，Petitti DB.Hormone therapy to prevent disease and prolon life in postmenopausal women ［J］.Ann In-tern Med，1992;117（12）:1016-1037.
　　［2］Barrett-Conner E.Hormone replacement therapy ［J］.BMJ，1998;317:457-461.
　　［3］Sherwin BB.Hormones，mood and cognitive functioning in post-menopausal women ［J］.J Obstet Gynecol，1996;87（Suppl2）:20S-26S.
　　［4］Huang YH，Ye XQ.Effect of kidney notic recipes on osteoporo-sis in Perimenopausal women ［J］.Zhongguo zhongxiyi Jiehe Zazhi（Chin J Integrated Tradit Western Med），1993;13（9）:522-523.
　　［5］Ye XQ，Gao XJ，Guo Y.Treatment effects of Jiarongpian on functional unbalanced sex gland axis in women ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1989;10（2）:101-102.
　　［6］Marsden J，Baum MS，Sacks NPM.Hormone replacement ther-apy in women with previous breast cancer ［J］.Trends Endocr Metab，1998;9:32-38.
　　［7］Persson I，Weiderpass E，Bergkvist L.Risks of breast and en-dometrial cancer after estrogen and estrogen-progestin replace-ment ［J］.Cancer Causes Control，1999;10（4）:253-260.
　　［8］Eriksen EF，Kasdaul B.European and North American experi-ence with HRT for the prevention of osteoporosis ［J］.Bone，1996;19（Suppl5）:179s-183s.
　　［9］Finkel E.Phyto-oestrogens:The way to postmenopausal health ［J］.Lancet，1998;352（9142）:1762-1763.
　　［10］Johanna L，Mark M.For your information ［J］.Am Diet Assoc，1998;98（9）:974-976.
　　［11］Murkies AL，Lombard C，Strauss BJG，Wilcox G，Burger HG.Dietary flour supplementation decreases post-menopausal hot flushes:Effect of soy and wheat ［J］.Maturitas，1995;21:189-195.
　　［12］Yan Z，Tong TS，Joan EC，Patricia AM，Suzanne H.Daidzein and genistein glucuronides in vitro are weakly estrogenic and ac-tivate human natural killer cells at nutritionally relevant concen-trations ［J］.J Nutr，1999;129（2）:399-405.
　　［13］Scheiber MD，Rebar RW.Isoflavones and postmenopausal bone health:A viable alternative to estrogen therapy ［J ］.Menopause，1999;6（3）:233-241.
　　［14］Eden J.Phytoestrogens and the menopause ［J］.Baillieres Clin Endocrinol Metab，1998;12（4）:581-587.
　　［15］Kass-Annese B.Alternative therapies for menopause ［J］.Clin Obstet Gynecol，2000;43（1）:162-183.