关键词: 下颌骨髁状突;软骨;碱性磷酸酶
引言
髁突软骨细胞（mandibular condylar chondrocyte，MCC）体外培养时存在细胞形态变化、Ⅰ型和Ⅱ型胶原表达的更迭等表型变化特征［1］ ，但还不清楚MCC碱性磷酸酶（al-kaline phosphatase，ALP）活性的变化特点.本实验采用ALP活性测定和Von Kossa染色法对兔MCC进行检测，以补充对MCC这方面生物学特征的认识.
1 材料和方法
1.1 MCC的原代培养和鉴定
解剖显微镜下取1～2wk的新西兰白兔的髁突软骨组织，剪成约1mm3 大小，2.50g・L-1 胰蛋白酶37℃消化1h，1g・L-1 IA型胶原酶（Sigma）37℃消化2～3h，200目滤网过滤并收集细胞，反复贴壁法纯化细胞后，用含100mL・L-1 新生牛血清（Hyclone）的DMEM（Gibco）于50mL・L-1 CO2 培养箱孵育细胞.免疫组化方法鉴定细胞来源，主要试剂有兔抗牛Ⅱ型胶原多克隆抗体（Chemicon International Inc）和北京中山生物技术公司的通用型SP试剂盒，实验过程同常规.对照采用的成骨细胞来源于新生SD大鼠的颅骨，通过胰蛋白酶和胶原酶混合消化法获得.
1.2 ALP活性的测定
用含100mL・L-1 血清的DMEM配制矿化诱导液（10mmol・L-1 β甘油磷酸钠，50mg・L-1 Vitamin C，10-8 mol・L-1 地塞米松），ALP检测试剂盒采用北京中生生物技术公司产品.
将第3代MCC以及成骨细胞按4000个/孔接种于96孔板，每组设3个平行孔.接种后12d内每隔48h测定一次ALP活性.测定时吸弃培养液，PBS洗2次，加3mL・L-1 Triton X-1004℃过夜，然后加ALP底物反应液100μL37℃40～60min，0.5mol・L-1 NaOH终止反应.酶联免疫检测仪测定410nm波长时的吸光度，以时间、吸光度分别为横、纵轴，绘制曲线进行比较.
1.3 体外矿化能力的检测
细胞爬片用矿化液培养4wk和6wk后，用40g・L-1 多聚甲醛固定，50g・L-1 硝酸银溶液染色，紫外光下暴露10～15min，蒸馏水洗20min，50g・L-1 硫代硫酸钠还原30s，10g・L-1 中性红衬染，常规脱水封片，光镜下观察. 转贴于 2 结果
2.1 免疫组化结果
MCC在胞质有Ⅱ型胶原的阳性染色.
2.2 ALP活性的检测结果
矿化诱导液诱导出了MCC和成骨细胞ALP的活性，在同一时间点后者ALP的活性高于前者.MCC的ALP活性随培养时间的延长逐渐增加，但成骨细胞ALP活性在诱导早期（4～6d）有时间量效关系，后期ALP活性则变化不显著.
2.3 Von Kossa染色结果
成骨细胞在4wk出现较小的矿化结节，6wk时较明显;MCC在6wk时只出现散在的矿化点或矿化小结.
3 讨论
Ⅱ型胶原是软骨细胞的特征性产物，免疫组化结果表明MCC具有软骨细胞的特征.ALP活性是成骨细胞分化成熟的重要标志之一，成熟的软骨细胞只分泌较少的ALP，当细胞肥大化或钙化时.ALP的活性增加［2］ .由于髁突纤维软骨的组织特性，体外培养时分离出的MCC常常是处于不同分化阶段软骨细胞的混合体，因此，MCC存在ALP活性及形成钙化结节，一方面是因为其细胞群体中有钙化软骨细胞存在;另一方面可能是由于矿化液诱导部分软骨细胞肥大化或钙化，使分泌ALP的细胞数量逐渐增多，因而表现出ALP活性的逐渐增加，这些特征近似于体内细胞从增殖层向钙化软骨层递进时的变化特点.
参考文献
［1］Engel FE，Khave AG，Boyan BD.Phenotypic changes of rabbit mandibular condylar cartilage cells in culture ［J］.J Dent Res，1990;69（11）:1753-1758.
［2］Xu Y，Pritzker KP，Cruz TF.Characterization of chondrocyte alkaline phosphatase as a potential mediator in the dissolution of calcium pyrophosphate dihydrate crystals ［J］.J Rheumatol，1994;21（5）:912-919.转贴于