作者：刘颖格 戚好文 李焕章
【关键词】 原癌基因
关键词: 原癌基因;哮喘;气道重塑;豚鼠
摘 要:目的 观察原癌基因表达在哮喘气道重塑中的作用. 方法 卵蛋白致敏豚鼠建立哮喘模型，Dot-blot，North-ern-blot分子杂交及免疫组织化学技术观察豚鼠气道上皮、肺组织中原癌基因c-fos，c-myc，c-jun和c-sis的表达及其与气道重塑的关系. 结果 正常豚鼠气道及肺组织中c-fos和c-myc mRNA无或很少表达，哮喘发作后，豚鼠气道上皮及肺组织c-fos和c-myc mRNA表达明显增加;免疫组织化学染色显示Fos，Myc，Jun及Sis在正常豚鼠低水平表达，4种原癌基因产物表达增加.阳性反应细胞主要分布于气道上皮细胞胞质、气管及细支气管的上皮细胞胞核及浸润的炎症细胞中.病理结果显示气道粘膜及小支气管平滑肌周围淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，气道平滑肌显著增生. 结论 原癌基因表达在气道重塑过程中有重要作用.
Keywords:oncoges;asthma;airway remodeling;guinea pigs
Abstract:AIM To explore the role of proto-oncogenes in the process of airway remodeling in asthma.METHODS Guinea pigs were used as asthma models challenged by ovoglobulin.Dot-blot，Northern-blot molecular hybridization and immunohistochemistry techniques were used to detect the expression of c-fos，c-myc，c-jun and c-sis.RESULTS c-fos and c-myc mRNA could not be detected or expressed at very low level in the control group.They were greatly increased after the guinea pigs were challenged by ovoglobulin.30min after the challenge，the expressions of c-fos and c-myc mR-NA reached the peak and returned to normal4h after the challenge.Immunohistochemistry study showed that Fos，Myc，Jun and Sis expressed at low level in control group and increased after ovoglobulin stimulation.Immunohis-tochemically positive cells lay in the plasma of airway epithe-lium，in cell nucleus of bronchial epithelium and in inflamma-tory cells.Pathologic studies showed smooth muscle thick-ened around bronchia and lymphocyte infiltration under mu-cosa or around bronchia smooth muscle.CONCLUSION Proto-oncogenes expression plays an important role in the process of asthma airway remodeling.
0 引言
气道重塑（Airway remodeling）是支气管哮喘的重要病理特征之一，是哮喘长期反复发作的结果.许多因素如炎症介质、细胞因子及原癌基因都参与了这一过程.气道重塑是气道狭窄的重要原因，慢性气道炎症与气道重塑及气道高反应性的发生关系极为密切.原癌基因是生物体内的一类高度保守基因，控制细胞的生长和分化，同时参与炎症的发生.本研究通过检测豚鼠哮喘模型气道c-fos，c-jun及Fos，Jun，Myc，Sis的表达，以探讨它们与气道重塑的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 盐酸胍、SDS购自美国Sigma公司，［α-32 P］dATP为北京福瑞公司产品，缺口平移标记盒为BRI公司产品，c-fos，c-myc质粒及Fos，Myc蛋白抗体由本校解剖教研室提供，Jun多克隆抗体购自北京中山生物技术公司，Sis抗体购自Santa Cruz公司.
1.2 动物及标本制作 正常成年雄性豚鼠（本校实验动物中心提供）40只，体质量300～400g，随机分为实验组（20只）和对照组（20只），实验组用100g L-1 的卵蛋白生理盐水ip致敏，2wk后用10g L-1 卵蛋白生理盐水雾化激发，隔日1次，共10次.对照组用同样方法致敏，以生理盐水代替10g L-1 卵蛋白盐水雾化吸入，余同实验组.于最后1次诱发试验后3～5h用10g L-1 戊巴比妥钠经腹腔麻醉处死动物，以100mL冷生理盐水经右心室快速冲洗，再以300mL40g L-1 多聚甲醛缓慢灌注，固定40min，取气管、不同部位支气管置于同一固定液中固定12h，随之浸泡于4℃，200g L-1 蔗糖液内，于-20℃制备40μm厚片和15μm的邻片.
1.3 总RNA的提取 放血处死动物，立即剥离气道及肺组织，置-70℃冰箱冻存，异硫氰酸胍-饱和酚-氯仿法提取总RNA［1］ .
1.4 气道及肺组织c┐fos，c┐myc mRNA的测定 用含c-fos和c-myc的cDNA质粒，按Sambrook等［2］ 方法转染细菌，扩增制备质粒，相应内切酶酶切后用低融点琼脂糖法回收cDNA片段，［α32 P］-dATP缺口平移法分别标记fos和myc基因cDNA探针片段，然后进行RNA斑点杂交和Northern杂交.
1.5 Fos和Myc蛋白的免疫组化染色 ABC法按序PBS漂洗组织切片，以30mL L-1 羊血清1 200稀释一抗，二抗以1 200稀释，孵育1h，经PBS，Tris-HCl缓冲液充分漂洗，DAB显色，Mayer苏木精复染2min.以10mmol L-1 磷酸盐缓冲液、正常羊及兔血清取代第一抗体行空白对照与替代对照.
1.6 Jun蛋白免疫组织化学染色 按ABC法进行，40μm厚切片置入含3mL L-1 h3 O2 的甲醇溶液（800mL L
-1 甲醇配制）30min，加入含1mL L-1 Triton X-100的绵羊抗Jun血清（1 400，10mmol L-1 PBS pH7.2～7.4配制），37℃孵育30min，4℃孵育48h，加入生物素化兔抗绵羊IgG（1 300，10mmol L-1 PBS配制），4℃孵育24h，置入Strept-Avidin-HRP（1 300，10mmol L-1 PBS配制），室温下孵育2～3h.用含0.5g L-1 DAB和0.1mL L-1 h3 O2 的50mmol L-1 Tris缓冲液（pH7.6）呈色.空白对照与替代对照同前.
1.7 Sis蛋白免疫组织化学染色 切片水化后入3mL L-1 h3 O2 甲醛液中孵育20min，3mol L-1 尿素消化30min，加入兔抗人Sis多克隆抗体（工作浓度1 100），4℃过夜，次日37℃复温1h，生物素化羊抗兔IgG（工作浓度1 200）37℃孵育40min，ABC复合物（工作浓度1:100）37℃孵育30min，DAB显色.空白对照与替代对照同前.
2 结果
2.1 病理结果 经过10次激发实验后，豚鼠气道上皮水肿、脱落明显，气道平滑肌显著增生，平滑肌下层亦有明显增厚、水肿.激发实验4h后，气道粘膜及小支气管平滑肌周围有少量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及 中性粒细胞浸润，12～24h后上述细胞浸润加重，粘膜下层及粘膜上皮内以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主.
2.2 Dot┐bolt与Northern┐blot分子杂交结果 正常豚鼠气道上皮可见c-fos mRNA和c-myc mRNA低水平表达，哮喘发作后，气道c-fos mRNA和c-myc mRNA的表达明显增强，30min达高峰并持续至120min，240min时其表达水平接近正常.Dot-blot与Northern-blot杂交的结果一致.
2.3 Fos，Myc免疫组化染色结果 Fos，Myc阳性反应的细胞可见棕黑色颗粒，在气管主要分布于气道上皮细胞胞质及气道上皮层的游离缘，在小支气管则分布于上皮下间质（Fig1，2），平滑肌细胞及肺间质仅有少量反应，实验组的阳性颗粒数目明显高于对照组.
2.4 Jun免疫组化染色结果 Jun蛋白呈深褐色，主要分布于气管、支气管及细支气管的上皮细胞核中（Fig3），成纤维细胞、血管内皮细胞及炎症细胞可见少量阳性表达，其阳性颗粒呈致密排布.正常对照组气管及支气管上皮细胞无或只有极少数有阳性颗粒. 2.5 Sis免疫组化染色结果 实验组动物气道壁及周围组织中可见大量Sis阳性反应细胞，阳性细胞主要为气道粘膜上皮细胞及浸润的炎症细胞（Fig4）.对照组动物气道无Sis阳性反应细胞.
3 讨论
气道重塑是指由于支气管哮喘反复发作而导致的气道壁重新塑形.气道炎症细胞释放的炎症介质及细胞因子所致的气道平滑肌及间质细胞增生是气道重塑的重要原因.近年来的研究表明，原癌基因几乎参与信号传递通路的每个环节［3，4］ ，各种刺激如神经递质、激素、炎性介质等在数分钟内即可引起该类基因的表达，原癌基因的表达可加速细胞因子及炎症介质的表达与释放，促进细胞的增殖与分化，增加细胞对炎症介质的敏感性［5］ .因此原癌基因的表达对气道炎症的发生及气道重塑有重要作用.
实验表明组织胺、IL-1，TNF及内皮素等多种因素参与了气道重塑，各种炎症因子如外源性抗原、5-HT等均可迅速导致原癌基因的表达［6］ ，而其蛋白表达产物如Jun，Fos可形成AP-1，可促进多种细胞因子的表达，其中IL-2的表达可激活Ts，Th淋巴细胞，并诱导更多的细胞因子表达，如TNF-β，IL-4，IL-8等，AP-1还可诱导IL-5的表达，IL-5不仅可以促进细胞合成免疫球蛋白，还可趋化嗜酸性粒细胞，延长嗜酸性粒细胞存活时间，并诱导嗜酸性粒细胞分化［7］ ，而嗜酸性粒细胞的增多在过敏性哮喘的发病中有重 要作用.
实验表明，实验动物在哮喘发作后短期内即有c-fos及c-myc mRNA的表达，说明c-fos，c-myc的表达是哮喘发作后的早期事件之一，c-fos，c-myc基因的过量表达可导致多种炎症介质的释放，这是气道重塑的重要原因.阻断c-fos基因的表达，对于哮喘患者气道重塑及哮喘症状的控制有积极的意义.Lane等［8］ 更进一步的研究发现，激素抵抗的哮喘患者其外周血c-fos的表达率、mRNA的翻译和其蛋白产物的表达水平较激素敏感组更高，说明c-fos的高度表达不仅可以增加AP-1的水平，也许还与激素结合受体的下调有关.
c-myc亦是早期立即基因，其基因表达产物Myc可诱导气道平滑肌增殖、生长和分化，是气道重塑的另一重要因素.本实验发现，实验动物在受刺激后30min c-myc基因的表达即达高峰，并维持至120min.Burgess等［9］ 利用c-myc的反义寡核苷酸转染平滑肌细胞，可抑制平滑肌细胞进入S期，使之不能增殖，说明c-myc基因的表达是哮喘患者气道重塑的重要因素之一.由于气道反应性的高低与气道壁厚度密切相关，因此，c-myc的表达亦与气道高反应性有关，且使基底膜增厚，这是造成气道壁增厚的主要原因.
PDGF-B是c-sis基因的产物，PDGF-B不仅可刺激气道平滑肌细胞、成纤维细胞增殖、分化，还可诱导c-fos，c-jun的表达［10］ .本试验显示致敏动物诱发哮喘后，不仅气道粘膜上皮PDGF-B表达增加，气道粘膜浸润的炎症细胞内PDGF-B表达亦明显增加，推测PDGF-B以多种形式参与哮喘的发病.PDGF-B在气道上皮的表达也许是其通过旁分泌机制作用于气道平滑肌，PDGF-B在炎性浸润细胞的表达也许是其通过刺激多种炎性细胞表达多种细胞因子而起作用的，因此，PDGF-B在气道的表达是气道重塑的重要分子机制之一.
本实验显示Fos，Myc在气管主要分布于上皮细胞胞质及上皮层的游离缘，在小支气管则分布于上皮下间质，Jun主要分布于气管、支气管及细支气管的上皮细胞核中，成纤维细胞、血管内皮细胞及炎症细胞可见少量阳性表达，Sis主要分布于粘膜上皮细胞及浸润的炎症细胞，说明不同部位气道上皮原癌基因的表达有一定的差别，不同部位原癌基因对于气道重塑有不同作用.
总之，原癌基因Fos，Jun，Myc，Sis的表达对于慢性气道炎症、气道重塑及气道高反应性的形成均有重要作用.
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