作者：杨光 蔡振杰 张铁柱 汪曾炜
【关键词】 ，保存
关键词: 保存，生物学;抗原性;移植，同种;主动脉;主要组织相容性抗原Ⅰ类
摘 要:目的 探讨液氮低温保存对同种异体主动脉移植物抗原性的影响. 方法 采用细胞培养技术和流式细胞仪技术研究液氮低温保存对大鼠主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞主要组织相容性抗原Ⅰ类（MHCⅠ类抗原）表达的影响.建立大鼠同种异体主动脉移植模型，采用免疫组织化学实验研究新鲜主动脉和低温保存的主动脉同种异体移植后MHCⅠ类抗原和MHCⅡ类抗原表达的区别. 结果 正常培养的大鼠主动脉平滑肌细和成纤维细胞MHCⅠ类抗原表达的阳性率分别为（88.7±4.3）%和（84.8±2.0）%;液氮低温保存的大鼠主动脉平滑肌和成纤维细胞在复苏后MHCⅠ类抗原表达的阳性率分别为（89.4±3.5）%和（81.9±2.7）%.统计学分析表明大鼠主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞的MHC I类抗原表达在液氮低温保存前后无显著性差别.免疫组织化学实验研究表明新鲜主动脉和低温保存的主动脉同种异体移植后MHCⅠ类抗原和MHCⅡ类抗原表达无显著的差异. 结论 液氮低温保存对大鼠主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞MHC类的抗原性没有明显的影响.
Keywords:preserration，biological;antigenicity;transplan-tation，homologous;aortic;histocompatibility antiqens clussⅠ
Abstract:AIM To investigate the effect of fluid nitrogen cryopreservation on the MHC antigenicity of aortic homo┐grafts.METHODS By means of cell culture and flow cy-tometry we studied the effect of fluid nitrogen cryopreser-vation on the expression of MHCⅠantigen of smooth mus-cle cells and fibroblasts of aortic homografts of rats.With the establishment of animal models of aortic homograft trans-plantation，using immunohistochemical staining，the differ-ence of the expression of MHCⅠantigen and MHCⅡanti-gen was detected between fresh aortic homografts and cryop-reserved aortic homografts.RESULTS Expression rate of MHCI antigen of cultured smooth muscle cells and fibroblast was（88.7±4.3）%，（84.8±2.0）%respectively;and that of the revived smooth muscle cells and fibroblasts of aortic homografts after cryopreservation was（89.4±3.5）%，（81.9±2.7）%respectively.Statistically，there was neither significant difference of MHCⅠantigen expression of smooth muscle cells and fibroblast of aortic homografts be-tween before and after nitrogen fluid cryopreservation（P&>0.2，P&>0.1），nor difference of the expression of MHCⅠantigen and MHCⅡantigen between fresh aortic homografts and cryopreserved aortic homografts.CONCLUSION Fluid nitrogen cryopreservation has no obvious effect on the MHC antigeniacity of aortic homografts of rats.
0 引言
同种异体主动脉是心血管外科常用的修补和替代材料，其移植后的免疫排斥反应是影响移植远期效果的重用因素［1］ .液氮低温保存是同种异体主动脉移植物比较成熟的保存方法，在临床上已被广泛地采用.液氮低温保存方法对同种异体主动脉的抗原性影响是同种异体主动脉移植过程中非常重要的问题，同时也是一个有争议的问题［2-4］ ，在国内外都未见定量研究.我们采用细胞培养方法和流式细胞仪技术，在细胞水平定量研究低温（-196℃）对大鼠的主动脉平滑肌和成纤维细胞抗原性的影响.
1 材料和方法
1.1 实验1:液氮低温保存对培养平滑肌和成纤维细胞MHC抗原的影响
1.1.1 材料 SD大鼠，雌雄不限，体质量150～180g，由本校实验动物中心提供.小牛血清（FCS）（浙江四季青生物制品研究所）;RPMI1640培养基（Gibco公司）;胶原酶（Sigma公司）;胰蛋白酶（Sigma公司）;消化液:12g L-1 胰蛋白酶10mL，2g L-1 ED-TANa2 10mL，生理盐水80mL分装，-20℃保存;小鼠抗大鼠MHCⅠ类抗原mAb（mouse-anti-rat MHCⅠantigen mAb）（本校免疫教研室提供）使用浓度:PBS（pH7.4，0.01mol L-1 ）50倍稀释;羊抗小鼠IgG荧光抗体（goat anti mouse IgG FITC）（北京军事医学科学院邦定公司）使用浓度:PBS（pH7.4，0.01mol L-1 ）10倍稀释;流式细胞仪（美国Coulter公司）.实验分组:A.正常培养的平滑肌细胞组;B.经液氮低温保存的平滑肌细胞组（4wk）;C.正常培养的成纤维细胞组;D.经液氮低温保存的成纤维细胞组（4wk）.
1.1.2 方法 取150～180g（8～10周龄）的SD雄性大鼠，用乌拉坦（800mg kg-1 ）ip麻醉，无菌条件下取出主动脉，按Chamley-Campbell［5］ 的贴壁方法培养平滑肌细胞和成纤维细胞.细胞生长致密时，以1.2g L-1 胰蛋白酶及0.2g L-1 EDTANa2 消化液消化传代.实验采用第3代传代细胞.用20g L-1 胶原酶和2.5g L-1 胰蛋白酶消化细胞，PBS（pH7.4，0.01mol L-1 ）洗涤2次（冻存的细胞复苏后用培养液将DMSO置换出，再经PBS洗涤），调整细胞密度为109 L-1 .取50μl细胞悬液加小鼠抗大鼠MHCⅠ类抗原mAb50μL（工作浓度），4℃条件下保持60min，无关抗体对照组加羊抗兔IgG mAb.洗涤液洗涤2次后加工作浓度的羊抗鼠IgG荧光抗体，充分振摇，4℃保持30min.洗涤液2mL洗涤2次，1000r min-1 离心5min，加固定液1mL上流式细胞仪测定.
1.2 实验2:液氮低温保存对移植同种异体主动脉MHC抗原的影响
1.2.1 材料 上海雄性SD大鼠100只，供体50只，体质量180～230g，受体50只，体质量250～300g（本校动物实验中心）.显微外科手术器械包（上海手术器械厂），11-0显微外科缝线（杭州富阳医用缝合线厂）.第1抗体:小鼠抗大鼠MHCⅠ类抗原mAb，使用浓度1 100（北京邦定公司），小鼠抗大鼠MHCⅡ类抗原mAb，使用浓度1 50（北京邦定公司），第2抗体:羊抗小鼠IgG ABC试剂盒，使用浓度1 200（Vec-tor公司）.动物分组:A组，新鲜同种主动脉移植组，B组:低温（-196℃）保存的同种主动脉移植组.
1.2.2 方法 供体大鼠麻醉后开胸，在14倍手术显 微镜下分离出主动脉带瓣管道，去除外膜并结扎左右冠状动脉，4℃生理盐水清洗后，用Kirklin和Barret-Boyes方法进行低温保存［5-7］ .同种异体主动脉移植的动物模型采用同种带瓣主动脉异位植入腹主动脉的方法［1，8］ .受体SD大鼠用乌拉坦（800mg kg-1 ）ip麻醉后在无菌条件下纵切腹部，于14倍手术显微镜下分离腹主动脉，在肾动脉分支以下和左右股动脉分支点以上确定移植位点.移植位点近端与远端用血管夹阻断血流，切断腹主动脉，以端对端的吻合方式将带瓣主动脉植入受体大鼠的腹主动脉，吻合线为显微外科缝线，以间断缝合方式吻合.腹主动脉血流阻断时间一般为30～40min.假移植手术组的大鼠将腹主动脉切断后直接吻合.每组分别于术后3，7，14，21和28d取材，每组每次处死动物为5只，移植受体大鼠颈动脉放血后，剪开腹腔，在14倍手术显微镜下分离取出移植物.取出的移植物经生理盐水冲洗后，置于40mL L-1 多聚甲醛固定6～24h，常规脱水，石蜡包埋，制成5μm石蜡切片，待免疫组织化学染色.阴性对照染色抗体为鼠抗人血型抗原A mAb（华美生物工程公司）;阳性对照采用同种异体主动脉移植4wk后的标本.ABC法染色［9］ :小鼠抗大鼠MHCⅠ类抗原和MHCⅡ类抗原mAb（第1抗体）稀释至1 1000，生物素化羊抗小鼠IgG抗体（第2抗体）稀释至1 200，avidin标记的ABC复合体稀释至1 200.第1抗体在37℃反应60min，再加入生物素化第2抗体37℃下反应30min，然后加入avidin标记的HRP复合体反应60min，标本最后加DAB-h3 O2 液显色，复染，室温下自然干燥，脱水，透明，封片后光学显微镜下观察.根据染色（阳性为棕褐色）的程度和范围积分（0～5）［10］ :0分，阴性;1分，极弱阳性;2分，弱阳性;3分，中度阳性;4分，强阳性;5分，极强阳性.
统计学处理:所有数据均以x ±s表示，以组间t检验进行统计学分析.
2 结果
培养的平滑肌细胞与冻存复苏后的平滑肌细胞MHCⅠ类抗原表达无显著差异（Tab1）.正常培养的成纤维细胞与冻存复苏后的成纤维细胞MHCⅠ类抗原表达无显著差异（Tab1）.阳性对照标本MHCⅠ和MHCⅡ染色均为强阳性（）;阴性抗体对照染色均为（-）.A组与B组MHCⅠ类抗原分子表达染色积分无显著差异（Tab2）.A组与B组MHCⅡ类抗原分子表达染色积分无显著差异（Tab3）.
表2 移植物MHCⅠ类抗原分子表达染色积分 略
表3 移植物MHCⅡ类抗原分子表达染色积分 略
3 讨论
目前液氮低温保存方法是同种异体主动脉和肺动脉移植物比较成熟的保存方法，但液氮低温保存方法对移植物抗原性的影响是同种异体主动脉和肺动脉移植过程中至关重要的问题.在此问题上存在两种观点:①液氮低温保存方法可以降低同种异体主动脉移植物的抗原性;②液氮低温保存方法对同种异体主动脉移植物的抗原性没有影响.Fontan等［2］ 认为长期低温保存可降低同种异体主动脉移植物的抗原性，Shumway［3］ 也认为只有新鲜的同种异体主动脉移植物才能激发宿主的免疫反应.Khatib等［4］ 在非近交系大鼠的同种异体主动脉移植中发现液氮低温保存 方法并不能使同种异体主动脉移植物对宿主的抗移植物的免疫排斥反应的致敏作用减弱.Cochran等［11］ 在移植物的皮下包埋实验中也证明了液氮低温保存方法并不能降低移植物的抗原性.羊的同种异体主动脉移植实验表明液氮低温保存的移植物在移植后淋巴细胞浸润多于4℃营养液保存的移植物，这说明液氮低温保存方法保存了血管组织的抗原性，并引起宿主动物的免疫排斥反应［12］ .Salomon等［13］ 和Yankah等［14］ 也在实验中证明液氮低温保存的主动脉平滑肌细胞和内皮细胞能表达MHCⅠ类和Ⅱ类抗原，但没有与正常主动脉平滑肌细胞和内皮细胞进行定量的对比研究.总之，大多数作者认为液氮低温保存不能改变移植物的抗原性，但都没有精确定量的分析和研究结果.
我们采用流式细胞仪技术，对培养的主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞的MHCⅠ类抗原分子的表达进行定量研究，发现液氮低温保存对平滑肌和成纤维细胞的MHCⅠ类抗原分子的表达没有明显的影响，平滑肌细胞冻存前MHCⅠ类抗原表达率为（88.7±4.3）%，冻存复苏后的表达率为（84.8±2.0）%，两组之间没有显著差异，成纤维细胞冻存前MHCⅠ类抗原表达率为89.4%，冻存复苏后表达率为（81.9±2.7）%，两组之间没有显著差异.实验中我们还发现主动脉的平滑肌细胞与成纤维细胞的MHCⅠ类抗原分子表达在冻存前后都没有明显差别.对同种异体主动脉移植后移植物的免疫组织化学实验也证明新鲜主动脉（A组）与低温保存的主动脉（B组）移植物MHCⅠ类和Ⅱ类抗原分子的表达没有显著差异，这说明液氮低温保存对移植物的抗原性没有影响.这些都证明了液氮低温保存没有影响移植物的抗原性.总之，液氮低温保存方法不能改变移植物的抗原性，这对同种异体主动脉和肺动脉移植是不利的因素，可见液氮低温保存移植物有明显的优点，同时也有致命的弱点.如何能在保存移植物组织生物活性的同时降低移植物组织的抗原性有待于进一步的研究.
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