关键词: 视上核;脑片;全细胞记录;吗啡;突触传递
摘 要:目的 研究吗啡对大鼠视上核神经元兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic currents，EPSCs）的影响，并对其突触机制进行探讨. 方法 采用脑片膜片钳全细胞记录技术，在电压钳状态下，记录吗啡对大鼠视上核神经元EPSCs和mEPSCs（miniature EPSCs）的影响. 结果 20μmol L-1 的吗啡可分别使大鼠视上核神经元的EPSCs的频率下降65%，幅度减少44%，mEPSCs频率下降45%，幅度减少12%. 结论 吗啡通过突触前机制抑制视上核神经元突触前兴奋性递质的传递.
Keywords:supraoptic nucleus;brain slice;whole-cell recording;synaptil transimission
Abstract:AIM To observe the effects of morphine on the excitatory postsynaptic currents（EPSCs）and miniature EP-SCs（mEPSCs）in rat supraoptic nucleus（SON）neurons and to determine its synaptic mechanism.METHODS Using whole-cell voltage-clamp recording technique in brain slices，the EPSCs and mEPSCs of rat SON neurons were recorded，respectively.RESULTS 20μmol L-1 morphine decreased the frequency of EPSCs and mEPSCs（EPSCs by65%，mEP-SCs by45%），and decreased the amplitude of EPSCs by44%in all SON neurons，but had no effect on the amplitude distri-bution of mEPSCs.CONCLUSION Morphine inhibits the excitatory transmissions via presynaptic mechanisms in SON neurons from rat brain slices.
0 引言
视上核（supraoptic nucleus，SON）内分泌大细胞主要通过体液途径来调控机体的内平衡和自主功能.当受到应激、吸吮、渗透压改变以及其他生理刺激时，视上核神经元就会释放催产素或（和）加压素入血以及其在脑干边缘系统的投射区域［1，2］ ，在激素释放过程中视上核神经元的放电模式起了决定性作用，而放电模式主要由视上核神经元内在膜特性和突触输入的综合作用调控［3］ .
阿片是一种重要的神经调质，能抑制视上核神经元的内分泌活动.阿片的这种抑制作用主要通过直接抑制视上核神经元来实现，但在许多脑区阿片还能通过抑制突触递质的释放从而影响突触后神经元的电学特性［4］ .在视上核，阿片是否也能通过抑制突触前递质的释放来影响内分泌大细胞的电活动，尚没有明确结论，本实验采用脑片膜片钳全细胞记录方法研究吗啡对视上核神经元兴奋性突触传递的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 成年SD雄性大鼠，体质量约250g，由本校实验动物中心提供.蔗糖ACSF的成分为（mmol L-1 ）:蔗糖250，KCl2.5，CaCl2 2，Mg-SO4 2，Nah3 PO4 1.25，NaHCO2 25.ACSF的成分为（mmo l L-1 ）:NaCl125，KCl3，CaCl2 2，Mg-SO4 2，Nah3 PO4 1.25，NaHCO2 25，葡萄糖10.蔗糖ACSF电极内液的成分（mmol L-1 ）:K-Glu-conate140，MgCl2 2，Hepes10，ATP2，KOH调pH为7.2.bicuculline、盐酸吗啡（morphine），CN-QX，APV，naloxone和TTX（Sigma产品）在实验前溶解于ACSF.
1.2 方法
1.2.1 脑薄片的制备 大鼠经ip氯胺酮（100mg kg-1 ）麻醉后，使用0～4℃经950mL L-1 O2 和50mL L-1 CO2 饱和的蔗糖人工脑脊液（artificial cere-brospinal fluid，ACSF）进行心脏灌流，然后断头并迅速取脑，快速置于冰冷的0～4℃经950mL L-1 O2 和50mL L-1 CO2 饱和的蔗糖人工脑脊液中.待脑完全冷却后，对视上核所在脑区进行修块，然后在震动切片机（Campden Instruments，USA）上制备厚度约为300μm的含视上核的水平下丘脑脑片，并置于26℃的持续充以950mL L-1 O2 和50mL L-1 CO2 的ACSF中孵育.
1.2.2 实验记录 脑片在26℃的ACSF中孵育至少2h，待脑片恢复后移至记录槽，用尼龙网及U形铂丝框加以固定，并以1～2mL min-1 的速度灌流26℃的充以950mL L-1 O2 和50mL L-1 CO2 的AS-CF.在解剖镜（×15）下根据大鼠脑定位图谱分辨视上核，采用“盲插”方法进行全细胞记录.玻璃微电极由PP-83电极拉制器（日本Narishige公司）拉制，尖端开口约2μm，充以电极内液.封接前微电极阻抗为3～7MΩ，封接电阻为2～6GΩ，串联电阻在20MΩ以下.在形成全细胞记录方式后，单细胞的生物电信号经膜片钳放大器Axopatch300A放大，并由Digi-Data1200板进行A/D转换后，输入计算机，由软件包Pclamp6.0.2（美国Axon公司）进行数据采集和分析，对细胞的指令信号由计算机经D/A转换后给出.采样频率为10kHz，电信号均低通贝塞尔滤波（Lowpass Bessel Filter），-3d频率为2kHz.
统计学处理:实验数据以x ±s表示.对同一神经元的兴奋性突触后电流EPSCs和微小的兴奋性突触后电流mEPSCs的分析采用累积概率，对其频率和幅度的分布采用Kolmogorov-Smirnov检验.对多个神经元的EPSCs及mEPSCs的频率和幅度分析采用相对值，并用配对t检验.
2 结果
在全细胞电流钳记录方式下测得视上核神经元的静息膜电位为（55±8）mV（n=38）.大部分神经元都有自发的动作电位发放，放电分为两种，一种为位相型放电，一种为非位相型放电，这可能和神经元的类型有关（加压素神经元和催产素神经元）.神经元膜的输入阻抗为（530±110）MΩ，膜的时间常数为（34±13）ms.加入20μmol L-1 吗啡，所有的视上核神经元都表现为超极化，自发放电的频率下降.
图1 略
2.1 吗啡对视上核神经元EPSCs的影响 采用全细胞电压钳记录方式，把视上核神经元的钳制电位保持在静息膜电位附近（-60mV），在灌流的ACSF中加入30μmol L-1 的GABAA 受体阻断剂bicuculline以阻断抑制性突触后电流的情况下，可记录到EP-SCs，它几乎可被非NMDA受体阻断剂CNQX（10μmol L-1 ）和NMDA受体阻断剂APV（20μmol L-1 ）完全阻断，证明视上核神经元的EPSCs主要为谷氨酸能.在灌流的ACSF中加入20μmol L-1 的吗啡3min后，视上核神经元的EPSCs的频率和幅度都下降（Fig1）.
EPSCs的频率明显下降（P&<0.01配对t检验，n=13），平均下降（65±13）%;EPSCs的幅度降低（P&<0.05配对t检验，n=13），平均减少（44±11）%（Fig2），吗啡的作用具有冲洗效应，且可被naloxone阻断.
2.2 吗啡对视上核神经元mEPSCs的影响 在灌流的ACSF中加入1μmol L-1 的TTX和30μmol L-1 的bicuculline，采用全细胞膜片钳电压钳记录方式（钳制电位为-60mV）记录视上核神经元的mEPSCs.20μmol L
-1 的吗啡可使mEPSCs的频率下降，而幅度改变不明显（Fig3）.
图2 － 图3 略
吗啡作用后mEPSCs的频率下降（P&<0.05配对t检验，n=15），平均下降（45±12）%，而幅度减小不明显（P&>0.05配对t检验，n=15），平均减小（12±5）%（Fig4）.
3 讨论
本实验表明，吗啡可减少视上核神经元EPSCs的频率并降低其幅度，这既可能是由于吗啡减少突触前兴奋性递质的释放概率或（和）释放的量子数目，也可能由于突触后膜对兴奋递质的敏感性降低.进一步的实验解释了这个问题，加入TTX阻断神经元的动作电位，记录mEPSCs，吗啡只降低mEPSCs的频率，而不改变其幅度，说明吗啡只是减少了视上核神经元突触前兴奋性递质释放的位点和每次释放的量子数目，而突触后膜对兴奋性递质的敏感性并未改变.这种作用是突触前的，而非突触后的. 文献［5］报道全身应用吗啡可抑制神经垂体催产素及加压素的分泌.这可能通过抑制视上核和室旁核内分泌大细胞的电活动或使神经垂体的兴奋一释放脱偶联来实现.视上核神经元含有阿片μ受体和κ受体，本实验及其他作者的实验证实，吗啡直接作用于μ受体引起视上核神经元超极化及放电频率下降［6］ .神经垂体的神经内分泌末稍上的κ受体与吗啡结合，可抑制催产素及加压素的释放［7］ .本实验中的吗啡的突触前作用与以上文献中的突触后作用并不冲突，相反说明吗啡在调节视上核大细胞内分泌活动的作用位点的多样性.这个结果与Onaka等［8］ 报道的吗啡可通过突触前机制抑制CCK诱导的去甲肾上腺素在视上核的释放相吻合.在中央灰质和海马，吗啡亦能通过突触前机制阻断其突触传递［9，10］ ，这说明在中枢神经系统吗啡通过突触前机制阻断递质的释放有一定的普遍性.
图4 略
外周刺激，如吸吮、渗透压改变、全身用CCK等都可刺激视上核神经元的内分泌活动，而且刺激中枢的几个部位亦能引起视上核神经元兴奋［11］ .这说明传入神经对视上核神经元的电活动有重要的调控作用.吗啡作用于这些传入神经元胞体上的μ受体和轴突末稍上的κ受体，减少兴奋性递质释放的概率及量子数目，从而间接抑制视上核神经元的电活动，达到调控视上核神经元内分泌的目的.
参考文献
［1］Ludwig M，Callahan MF，Neumann I，Landgraf R，Morris M. Systemic osmotic stimulation increases vasopressin and oxytocin release within the supraoptic neucleus ［J］.J Neuroendocrinol，1994;6（4）:369-373.
［2］Landgraf R，Neumann I，Pittman QI.Septal and hippocampal release of vasopressin and oxytocin during late pregnancy and parturition in the rat ［J］.Neuroendocrinology，1991;54（4）:378-383.
［3］ Schrader LA，Tasker JG.Presynaptic modulation by metabotropic glutamate receptors of excitatory and inhibitory synaptic inputs to hypothalamic magnocellular neurons ［J］.J Neurophysiol，1997;77（2）:527-536.
［4］Inenaga K，Imura H，Yanaihara N，Yamashita H.Kappa-selec-tive opioid receptor agonists leumorphin and dynorphin inhibit supraoptic neurons in rat hypothalamic slice preparations ［J］.J Neuroendocrinol，1990;2（3）:389-395.
［5］Pumford KM，Leng G，Russell JA.Morphine actions on supraoptic oxytocin neurones in anaesthetized rats:Tolerance after i.c.v.morphine infusion ［J］.J Physiol，1991;440（8）:437-454.
［6］Russell JA，Leng G，Bicknell RJ.Opioid tolerance and depen-dence in the magnocellular oxytocin system:A physiological mechanism ［J］.Exp Physiol，1995;80（3）:307-340.
［7］Russell JA，Coombes JE，Leng G.Morphine tolerance and inhi-bition of oxytocin secretion by kappa-opioids acting on the rat neurohypophysis ［J］.J Physiol，1993;469（9）:365-386.
［8］Onaka T，Leuckman SM，Guzman RG，Ueta Y，Kendrick K，Leng G.Presynaptic actions of morphine:blockade of cholecys-tokinin-induced noradrenaline release in the rat supraoptic nuleus ［J］.J Physiol，1995;482（1）:69-79.
［9］Vaughan CW，Christie MJ.Presynaptic inhibitory action of opi-oids on synaptic transmission in the rat periaqueductal gray in vitro ［J］.J Physiol，1997;498（2）:463-472.
［10］Capogna M，Gahwiler B，Thompson S.Mechanism ofμ-opiod receptor-mediated presynaptic inhibition in the rat hippocampus in vitro ［J］.J Physiol，1993;470（10）:539-558.
［11］Lenaud LP，Bourque CW.Neurophysiology and neuropharma-cology of hypothalamic magnocellular neurons secreting vaso-pressin and oxytocin ［J］.Prog Neurobiol，1991;36（2）:131-169.