作者：刘都户，张学庸，黄裕新，樊代明
【关键词】 胃肿瘤
关键词: 胃肿瘤;血管内皮生长因子;反义核酸 中图号:R730.23 文献标识码:A
摘 要:目的 利用本室构建的反义VEGF165 （血管内皮生长因子，vascular endothelial growth factor）真核表达载体，研究VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞生物学表型的影响. 方法 用阳性脂质体介导的基因转染技术，将VEGF反义RNA重组体转入人胃癌细胞系，观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现. 结果 VEGF反义RNA重组体转染胃癌细胞后，斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示，反义RNA基因转染技术可使VEGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比，G2 /M期细胞增加（0.39），而S期细胞减少（0.54）;克隆形成率（2.2%）低于未转染细胞（4.0%）;肿瘤细胞接种裸鼠后33d时，VEGF反义RNA表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136）mm3 明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363）mm结论VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长，另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.
Keywords:stomach neoplasms;vascular endothelial growth factor;antisense nucleotide
Abstract:AIM To investigate the effect of vascular en-dothelial growth factor（VEGF）antisense gene on the biolog-ical characteristics of human gastric cancer cells by antisense nucleotide technique.METHODS The VEGF165 antisense gene recombinant was introduced into gastric cancer cell line by lipofect transfection technique.Then the cell cycle，prolif-erative abiliyt in vitro and growth in nude mice of transfected cells were examined.RESULTS Introduction of the VEGF165 antisense construct into SGC-7901cells resulted in a marked reduction in the expression of VEGF-specific mRNA and protein by dot blot and immunofluorescence staining analysis in transfected tumor cells.Cell cycle analysis showed that compared with the parental cells，the number of trans-fected cells had an increase（0.39）in G2 /M phase，a decrease（0.54）in S phase，and its colony forming rate（2.2%）was lower than that（4.0%）of the control cells.The volume of tumor（345±136）mm3 in the nude mice inoculated with the cells transfected by antisense VEGF165 gene construct was greatly reduced in comparison with that（1534±363）mm3 in the nude mice inoculated with SGC-7901cells.CONCLU┐SION As repressing angiogesis，antisense VEGF gene transfection might inhibit the growth of solid tumor;in addi-tion，it might correlate with the proliferation of tumor cells.
0 引言
血管形成与肿瘤的发生、生长、转移及预后有密切的关系.目前治疗肿瘤的各种药物主要是针对肿瘤细胞本身进行的，但恶性肿瘤生长和转移的血管依赖性提示，通过抑制肿瘤新生血管形成可以防治肿瘤的生长与转移，开辟治疗肿瘤的第二战场［1，2］ .我们拟采用VEGF/VEGFR为靶点进行反义核酸抗肿瘤治疗，主要基于以下考虑:①VEGF是一个强有力的血管内皮细胞促分裂因子，并能增加毛细血管的通透性.许多实体肿瘤组织细胞均高水平表达VEGF［3-5］ ，且表达量与肿瘤的恶性程度正相关.正常组织中仅肾、卵巢等少数脏器有较高水平的表达 ［6，7］ .胃肠道肿瘤以外的正常上皮、增生性息肉、腺瘤则未见VEGF及其受体的表达［8］ ;②虽然发现至少有十四种生长因子具有刺激新生血管形成的作用，但只有VEGF专一作用于血管内皮细胞，而且现已发现有许多生长因子，如TGF-β刺激新生血管形成的作用是全部或部分通过诱导VEGF表达而实现的;③已有研究用VEGF单克隆或多克隆抗体有效抑制新生血管形成和肿瘤生长的报道.
1 材料和方法
1.1 材料
限制性核酸内切酶、无DNA酶的Rnase购自Promega公司，Lipofect Amine由Gibco公司提供.G418由Sigma公司提供.RNA地高辛标记试剂盒（SP6/T7）购自Boehringer Mannheim公司.FITC标记的羊抗兔IgG由Vector公司提供.人胃癌细胞系SGC-7901、宿主菌E.coli DH5α等均为本校全军消化性疾病研究所保存.含有605bp的VEGF165 cDNA基因被克隆在pGEM-3Zf（+）的BamHI位点质粒pGEM-hVEGF由美国加利福尼亚大学医学院癌症研究所Abraham教授惠赠;pcDNA3 真核表达载体由本校生物化学教研室柴玉波博士惠赠.根据质粒图谱，作者将EcoRI+HindIII消化pGEM-hVEGF后得到的VEGF165 cDNA反向克隆至由此两种酶消化后的pcDNA3 中，成功构建了反义RNA表达质粒-pcDNA-as-hVEGF.BALB/c裸小鼠由本校实验动物中心提供并饲养.
1.2 方法
1.2.1 VEGF反义基因转染及转染细胞的鉴定
SGC-7901细胞在含100mL・L-1 小牛血清的完全RPMI1640培养基中贴壁生长，37℃，50mL・L-1 CO2 条件下培养，以2.5g・L-1 胰酶消化传代.在6孔板中接种指数期生长的细胞，过夜培养，直至细胞50%汇片.用无血清RPMI1640液洗涤后，将DNA/Liposome复合物及无血清RPMI1640液加入待转染细胞孔中，5h后加入含200mL・L-1 小牛血清的完全RPMI1640培养液.培养48h后传代于含350mg・L-1 的G418选择培养液，挑选G418抗性克隆并扩增培养作进一步鉴定.①PCR分析，取VEGF cDNA5’端引物为a:3’GAGGAGGAA-GACGGTACCCACG5’，取3’端引物为b:3’CTAC ACTGTTCGGCTCCGCCACT5’，SP6序列为:3’GATATCACAGTGGATTTAG5’.分别用SP6+a，SP6+b两对引物对克隆细胞的DNA提取物进行PCR扩增;②VEGF RNA地高辛标记探针的制备，pcDNA-as-hVEGF质粒经HindIII酶切后，加入Dig标记用的NTP混合底物，即可以以SP6RNA聚合酶转录出正义VEGF RNA，用于检测反义RNA表 达;③RNA斑点杂交，提取克隆细胞的总RNA，变性后，点样于NC膜上，干燥烘烤后，65℃水浴预杂交3h.然后加入地高辛标记的VEGF RNA探针，60℃水浴杂交18h，最后加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体进行检测，NBT/BCIP呈色.
1.2.2 细胞生长试验
①生长曲线:将处于对数生长期的SGC-7901细胞、携带有pcDNA-as-hVEGF和pcDNA3 空载体细胞分别接种于24孔培养板，37℃，50mL・L-1 CO2 孵育，以2.5g・L-1 胰酶消化计数，连续6d绘制生长曲线.②集落形成试验:将细胞作梯度倍数稀释，以50，100，200个细胞/皿的密度接种于含10mL预温37℃培养液的培养皿中，然后以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀.当出现肉眼可见的克隆时，终止培养，克隆计数并计算克隆形成率.③细胞周期测定:取对数期生长的细胞5×105 ，700mL・L-1 乙醇固定后加PI染料，进行FCM分析.④流式细胞仪免疫荧光检测:将5×105 细胞悬浮于10mL・L-1 副醛PBS液（pH7.0）中，室温固定30min，离心后重新悬浮于染色液（PBS+1g・L-1 triton-X-100+100mL・L-1 羊血清）中.封闭1h后离心，分别加入第一抗体及正常兔IgG，60min后加入FITC标记的羊抗兔IgG，最后进行流式细胞仪免疫荧光检测.⑤裸鼠移植瘤试验:以1.4×106 肿瘤细胞接种于BALB/c裸小鼠右侧大腿背部皮下.用精密卡尺测量肿瘤最大直径和横径.肿瘤体积为V=1/2（d×b2 ）［9］ .对不同数据分别采用卡方检验或t检验.
2 结果
2.1 靶基因导入人胃癌细胞的证据
①G418抗性筛选:与未转染的细胞相比，10d后可见转染pcD-NA3 空载体对照组、pcDNA-as-hVEGF实验组的细胞继续生长，而SGC-7901细胞大部分死亡，14d后，全部死亡.G418筛选2mo后，转染细胞仍继续生长.②PCR分析:用SP6+a和SP6+b两对引物分别对细胞染色体DNA进行PCR扩增，pcDNA-as-hVEGF转染的细胞可用SP6+b扩增大小约670个bp的片段，而用SP6+a未扩增出产物（Fig1）.③核酸分子杂交:应用VEGF正义RNA单链探针进行杂交时，从转染pcDNA-as-hVEGF细胞（SGC-as-hVEGF）中提取的RNA出现较强的杂交信号，其他细胞无杂交信号.
2.2 细胞生长试验
①曲线测定结果:SGC-7901及SGC-as-hVEGF细胞在完全培养基中的生长曲线如Fig2所示.这一结果表明，在正常培养条件下，VEGF的表达强弱对人胃癌细胞生长曲线无明显影响.②集落形成试验:平板培养14d SGC-as-hVEGF的克隆形成率为2.2%;SGC-7901为4.0%;SGC-pcDNA为4.8%.③细胞周期分布:用流式细胞仪检测细胞周期结果表明，SGC-as-hVEGF与SGC-7901细胞相比，G2 /M期细胞增加了0.39，而S期细胞减少了0.54（Tab1）.④VEGF免疫荧光检测:用FCM测定经FITC染色后的细胞荧光强度和阳性细胞数，间接反映细胞内VEGF含量变化.当阴性对照细胞（一抗为正常兔IgG）的荧光强度为1.8%时，SGC-7901细胞为31.6%，SGC-as-hVEGF为8.9%.表1 转染细胞周期分布（略）
2.3 VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响
实验分两组，SGC-as-hVEGF细胞接种的转染实验组和SGC-7901细胞接种的对照组，每组5只裸鼠.裸鼠在细胞接种6d可见肿瘤长出，8d始测量肿瘤大小，结果可以看出，接种后8d时，各组间的肿瘤大小无差别，从13d开始，VEGF反义转 染细胞所致的实体肿瘤生长速度明显变慢，肿瘤倍增时间增大.33d时处死动物，取肿瘤组织进行组织学检查，与SGC-7901细胞组相比，反义转染细胞组的肿瘤组织切片中，血管稀疏，肿瘤细胞缺血性变性坏死多见（Tab2）.表2 裸鼠移植瘤体积（略）
关于肿瘤的治疗，Denekamp［10］ 提出了这样的理论:联合肿瘤血管生成抑制剂和直接细胞毒药物最终将是合适的治疗恶性肿瘤的选择方案，但两者的机制应该作为两个领域分开进行研究.最早提出把抑制血管生成作为阻止肿瘤生长的治疗方法是在20世纪70年代，为进入临床应用已积累了许多动物实验资料.治疗机制可以归纳为以下3个方面:①抑制肿瘤细胞释放血管生成活性分子;②中和已释放的血管生成分子活性;③抑制血管内皮细胞对血管生成活性分子的反应.利用本实验室已构建的VEGF反义RNA表达载体，我们通过基因转染技术，在RNA水平阻抑肿瘤细胞VEGF的表达，从而以反证法研究了VEGF对肿瘤发生、生长的作用，在动物实验水平为肿瘤的拮抗血管生成治疗提供了一条可行的措施.
Melnyk等［11］ 将氯霉素乙酰转移酶（chloram-phenicol acetyl transferase，CAT）基因导入A431细胞（一种人表皮样癌细胞系）.转染子被注入免疫缺乏小鼠皮下，6wk后处死动物，A431转移灶的存在通过检测器官溶解物中的CAT活性而确定.实验发现，VEGF中和抗体不仅能抑制原发灶肿瘤的生长，也能抑制远处转移.结果提示，单独VEGF的抑制则可阻止体内肿瘤的生长和播散.Ramakrishnan等［12］ 将重组的VEGF与白喉毒素分子毒性部分（DT385）共价结合成对血管内皮细胞特异的细胞毒性化合物（VEGF165 -DT385），发现其对体外培养的人脐静脉内皮细胞和人微血管内皮细胞的生长呈特异性剂量依赖性抑制.在体内血管模型中，VEGF165 -DT385也能阻断bFGF诱导的血管生成.以上都是人们针对血管生成关键活性分子VEGF在抗肿瘤血管生成领域的探索，这些均显示，针对VEFG/VEGFR的抑制肿瘤血管生成研究在抗癌领域前景广阔.
反义技术即是根据碱基互补原理，利用与目标靶DNA或RNA特定互补的短链核苷酸片段封闭基因表达的方法，它包括反义DNA、反义RNA和Ri-bozyme（核酶）三大技术.反义RNA分为反义寡聚核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON）和载体表达的反义RNA（antisense RNA）［13-15］ .利用反义技术抑制癌基因的表达，抑制细胞生长因子的表达及与免疫调节治疗和化疗的协同抗肿瘤研究，近年来发展较快.某些反义制剂目前已经进入了II期临床［16］ ，但反义技术真正进入肿瘤临床治疗还需要进行许多工作.本实验通过Lipofect AMINE介导VEGF反义RNA进入人胃癌细胞，并通过G418筛选、PCR分析及RNA斑点杂交试验，均证明质粒DNA稳定地整合进细胞基因组中.
集落形成试验及细胞周期测定均提示，VEGF的表达与瘤细胞增殖能力可能有关.SGC-as-hVEGF的集落形成率能力比SGC-7901低，与亲本细胞相比，转染细胞的G2 /M期细胞增加了38.8%而S期细胞减少了53.6%.对转移细胞的生长曲线进行了测定，发现其无明显改变，细胞倍增时间一致.这点与集落形成试验并无矛盾，因为，肿瘤细胞系由不同比例的增殖及分化能力不同的瘤细胞群构成，共中仅小部分具有自我更新能力，即所谓的干细胞，干细胞为放射治疗及抗癌药物治疗的靶细胞，它与肿瘤的治愈、复发或转移关系密切.一般认为，只有干细胞才具有分化、形成集落的能力.我们发现高表达VEGF者，肿瘤生长速度快;而不表达或低表达者，肿瘤生长速度慢，但在致瘤率、出瘤时间及初时成瘤阶段肿瘤大小等方面并无明显差别，说明在肿瘤的血管期，VEGF对实体胃癌的生长有明显的促进作用;通过对VEGF的表达实行反义封阻技术，能明显阻抑胃癌的生长，加强了人们将VEGF/VEGFR作为靶点治疗实体肿瘤的信心，指出通过反义核酸技术阻断人胃癌的生长是可行的.
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