关键词: 胃癌;维拉帕米;药物疗法;化疗增敏剂;多药耐药性
摘 要:目的 观察无毒剂量钙拮抗剂维拉帕米（VPM）与小剂量化疗药阿霉素（ADM）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂（CDDP），合并用药前后对胃癌细胞影响实验研究. 方法 用MTT法观察其对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901，在VPM与ADM，5-FU和CDDP合并用药前后对细胞存活率的影响，并通过流式细胞仪检测细胞周期变化，透射电镜观察细胞超微结构变化. 结果 VPM与ADM，5-FU和CDDP合用与单独应用化疗药相比细胞存活率明显下降，ADM10μg・L-1 细胞存活率88%，CDDP100μg・L-1 77%，5-FU100μg・L-1 56%，合并用药后细胞存活率分别下降至49%，47%和29%.其增效倍数为单独用药的2.51～6.31倍（P&<0.001），细胞生长停止在S期，S期数分数为0.48，抑制细胞有丝分裂及DNA合成，细胞超微结构显示:细胞核固缩、空泡形成、微绒毛减少、线粒体及内质网肿胀. 结论 本研究表明无毒剂量VPM与小剂量化疗药合用，可获得化疗药单独用药相同疗效，VPM增加化疗药对肿瘤细胞的细胞毒作用，增加敏感性，减少药物副作用.
Keywords:stomach neoplasms;verapamil;drug therapy;chemosensitizers;multidrug resistance
Abstract:AIM To study the affect on cells from the antitu-mor effects of verapamil（VPM）combined with adriamycin（ADM）fluorouracil（5-Fu）and cispatin（CDDP）.
METHODS MTT assay was used to investigate the cytotox-icity of the drugs against human gastric carcinoma cell line in vitro SGC-7901inpidually or in combinations.Light and electron microscopes were employed to observe the changes in morphology of the cell treated with the drugs.Flow cy-tometry was applied to study the effects of the drugs on the cell cycle of the cell lines.RESULTS VPM significantly de-creased the survival level of cells with ADM，CDDP and5-Fu.Compared with that used inpidually，the potentiation of the combinations was ranged from2.51to6.31（P&<0.01）.The growth of cells stopped at Period S.The mitosis and the formation of DNA were restrained.The super-micro structure of cells showed nudeonic shrinkage and necrosis，swelling of mitochondria，dilation of endoplasmic reticulum and so on.CONCLUSION VPM can increase the sensitivity of carcinoma cells to kinds of antitumor drugs，and so reduce their side effects.
0 引言
化学治疗在胃癌治疗中占有很重要的地位［1-3］ ，但存在着药物毒性以及肿瘤细胞对化疗药物缺乏敏感性或产生多药耐药性（multidrug resistance，MDR）［4-7］ .使得肿瘤常规化疗面临新的挑战.近年来国外学者做了很多研究工作，其中钙拮抗剂（calci-um antagonist，CA）作为化疗增敏剂引起人们极大兴趣.我们应用MTT法、光镜、电镜、流式细胞仪，观察无毒剂量VPM与小剂量化疗药合并用药前后对人胃癌细胞SGC-7901影响，为胃癌治疗提供新疗法.
1 材料和方法
1.1 材料
阿霉素，深圳万乐有限公司产品.5-氟尿嘧啶，上海海普制药厂产品.顺铂，济南齐鲁制药厂产品.维拉帕米，德国Lud Wigshafen公司产品.RPMI1640细胞培养液，美国Gibco公司产品.胎牛血清，浙江金华清湖犊牛应用研究站产品.MTT试剂，美国Sigma公司产品.二甲基亚砜（DMSO），北京亚太精细化工公司产品.胰蛋白酶，美国Sigma公司产品.二氧化碳孵箱，美国Forma公司产品.酶联免疫仪，南京华东电子管厂产品.透射电子显微镜，日本JEM-EX产品.流式细胞仪ProfileII型，美国Conlter公司产品.人胃癌细胞株SGC-7901由本校唐都医院消化内科提供.将SGC-7901细胞置于含有100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液中，加青霉素100×103 U・L-1 、链霉素100×103 U・L-1 ，置于37℃，50mL・L-1 CO2 饱和湿度孵箱内培养，贴壁生长的细胞用2.5g・L
-1 胰蛋白酶消化传代.
1.2 方法
1.2.1 MTT试验
取对数生长期的SGC-7901细胞，以2.5g・L-1 胰蛋白酶消化，计活细胞数，以1×107 ・L-1 浓度细胞悬液接种于96孔培养板上，每孔100μL，培养24h加药.采取不同药物接触方案:①单加不同浓度VPM;②单加不同浓度3种化疗药;③不同浓度VPM分别与不同浓度3种化疗药联合同时加药;④空白对照组加等量培养液，设调零孔.每种药物浓度在0.001～1.0倍血浆最高浓度（PPC）范围之内.继续培养120h，每孔中各加20μL MTT溶液，继续培养4h用快速翻转培养板的方法［8］ 去除培养液，每孔加DMSO150μL，用微量振荡器振荡10min待形成的甲月替完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490nm测定光吸光度A（OD490），比色时空白孔调零.全部实验重复3次，取平均值，实验结果采取配对t检验分析.
1.2.2 细胞形态学检查
细胞超微结构观察:SGC-7901细胞经VPM分别与ADM，CDDP，5-FU联合用药及单独处理，在培养瓶内培养120h.药物浓度选择均为单独用药时对细胞增殖无抑制的浓度.VMP10000μg・L-1 ，ADM10μg・L-1 ，CDDP10μg・L-1 ，5-FU10μg・L－1 .经培养120h3.5g・L-1 胰蛋白酶消化、计数、离心、PBS洗涤，经20g・L-1 戊二醛和10g・L-1 锇酸水溶液先后两次固定，乙醇梯度脱水包埋、超薄切片、经双染色、透射电镜观察并摄片.
光学显微镜检查:培养器中放入载玻片进行细胞培养，分组及药物浓度同流式细胞仪检测.载玻片HE染色.
1.2.3 细胞周期动力学分析
分组及实验方法同前，经2.5g・L-1 胰蛋白酶消化，计数，PBS洗涤，离心，冰乙醇固定，再离心PBS洗涤后，制成1010 ・L -1 mL细胞悬液，经碘化丙啶（PI）对样品细胞DNA荧光染色，然后进行流式细胞仪测定，从打印的DIA含 量分布直方图，分析得到细胞周期各时相的百分率.①细胞存活率（VR） 根据A值计算各组细胞存活率，按以下公式计算［9］ .VR=实验组A值/对照组A值×100%.药物敏感性的判别标准［10］ :细胞存活率&<30%被测药物为高度敏感;细胞存活率为30%～50%被测药为中度敏感;细胞存活率&>50%被测药为不敏感.②半抑制浓度（IC50 ） IC50 细胞生长抑制达到50%时的药物浓度.根据各药物VR生长曲线经作图法求出IC50 .③合并指数（CI50 ） 根据联合用药物VR经作图法求出IC50 ，并计算IC50 时的CI50 ，按以下公式计算［11］ .CI50 =联合用药IC50 时的A药用量/A药单用时IC50 用量+联合用药IC50 时B药用量/B药单用时IC50 用量.当CI&<0.95时表示两种药物呈协同作用;CI&>1.05时呈拮抗作用;0.96
2 结果
2.1 VPM和化疗药单用对SGC┐7901细胞存活率的影响
将不同浓度的VPM分别单独处理细胞，结果表明在100～10000μg・L-1 浓度范围内对细胞存活率影响较小，镜下未见细胞形态学改变.在浓度为100000μg・L-1 时细胞数开始明显下降，因此选用10000μg・L-1 浓度为合并用药的增效浓度.不同浓度的ADM，5-FU，CDDP与SGC-7901细胞作用后，其对细胞存活率的影响呈浓度依赖性，浓度越高，细胞存活率越低（Tab1），SGC-7901细胞IC50 ADM50μg・L-1 ，5-FU135μg・L-1 ，CDDP316μg・L-1 .VPM与化疗药合用后IC50 ，细胞存活率、CI50 ，增效倍数比较（Tab2～4）.合并用药后与单独用药比较细胞存活率明显下降（Tab3）.SGC-7901细胞当ADM10μg・L -1 细胞存活率88%，CDDP100μg・L-1 77%，5-FU100μg・L-1 56%，合并用药后细胞存活率分别下降至49%，47%和29%.IC 50 :（Tab2），SGC-7901细胞单独用ADM50.12，CDDP316.22，5-FU134.90，加用VPM后分别为7.94，125.89，25.18.增效倍数在2.40～6.31（P&<0.01，Tab4）.说明联合用药后增加化疗药的疗效，减小半抑制浓度.VPM与ADM及5-FU合用增效倍数最高分别为5.38和6.31.合并指数CI50 ，中提示CI50 &<0.95，说明联合用药有协同作用. 表1 化疗药物作用下SGC-7901的存活率（略）表2 VPM与化疗药合用前后SGC-7901IC（略）表3 VPM与化疗药合用前后对SGC-7901细胞存活率（略）表4 联合用药对SGC-7901细胞CI（略）
2.2 细胞形态与周期
对照组与单用小剂量5-FU及VPM.HE染色细胞胞质丰富核大，深染，多个核仁，细胞轮廓清楚（Fig1）.VPM加5-FU处理后观察细胞胞质空泡变性，核破裂，核溶解（Fig2）.超微结构:对照组SGC-7901肿瘤细胞，胞核大，为单核或双核，胞质丰富，线粒体结构无改变，微绒毛排列整齐（Fig3，4）.单用5-FU线粒体结构无改变见（Fig5）.VPM+5FU组微绒毛明显减少，脂褐素形成，线粒体肿胀，核破裂，细胞死亡，胞质内空泡出现（Fig6～8）.利用FCM分析了细胞的动力周期各时相变化显示，对照组S期数分数为0.34，PI为0.55，单用VPM及小剂量5-FU对细胞增殖周期无明显影响，S期数分数皆为0.35.VPM与5-FU合用S期数分数0.48，G2 /M期为零，说明细胞阻滞在S期阻断了细胞有丝分裂，使肿瘤细胞数目减少，抑制生长 （Tab5）.表5 VPM与5-FU合用前后SGC-7901细胞周期（略）
3 讨论
化学治疗在胃癌治疗中占有很重要的地位，但其疗效不够理想，化疗有效率低的原因之一是由于肿瘤细胞对化疗药物缺乏敏感性或产生MDR［5，6，12］ .虽然高剂量药物能在一定程度上提高疗效，但剂量加大对正常组织的毒性也会增加.如何提高化疗的疗效，克服肿瘤细胞的MDR，成为肿瘤基础研究的热点.国内外学者做了很多探索与努力，其中最引人注目的化疗增敏剂为钙拮抗剂（CA）.已知CA是一种能选择性阻滞钙离子经细胞膜上的慢通道进入细胞，既减少钙离子内流的药物，目前广泛应用于心血管疾病及其他各系统疾病的治疗并取得了客观疗效.近年来为了克服肿瘤细胞的MDR，人们致力于寻找各种化疗增敏剂，其先决条件本身不具有细胞毒性，本实验证明VPM在低于血浆最高浓度3倍以下的10000μg・L-1 与SGC-7901细胞作用后，细胞存活率为92.4，说明VPM在10000μg・L-1 以下对肿瘤细胞无细胞毒性，此结果与文献报道相一致［13，14］ . 肿瘤细胞耐药分为内在性（未接触药物时原已存在的）和获得性（接触药物后产生的）两大类.耐药性是导致恶性肿瘤化疗失败的重要原因之一.应用化疗增敏剂克服肿瘤细胞的MDR是提高化疗疗效的一种潜在的重要手段.国外报道［15，16］ ，VPM、尼卡西平、尼莫地平、硫氮卓酮等CA能增强VCR，ADM，CDDP等在肿瘤中的积累，并增强其活性，使IC50 下降，延长荷瘤动物的生存时间.还有文献报道［17，18］ ，VPM能克服胃癌细胞对化疗药物ADM，VCR，5-FU等产生的耐药性.本实验结果表明，化疗药物ADM，CDDP，5-FU单独使用在浓度为10μg・L-1 时，对SGC-7901细胞存活率分别为88%，87%和86%，当加入无毒剂量VPM10000μg・L-1 ，其细胞存活率明显下降，在化疗药非致死剂量范围内，随着化疗药物浓度的递增，VPM增敏效果也相应增强;化疗药物单独处理癌细胞，在癌细胞敏感的大剂量药物水平，VPM增敏效果不明显.其增效倍数在2.51～6.31，ADM与VPM合用对SGC-7901增效倍数为6.31，5-FU与VPM合用对SGC-7901增效倍数为5.38，说明VPM与ADM，5-FU合用效果对SGC-7901细胞更为有效.VPM与化疗药合用后增加抗癌活性，合并指数&<0.90表明有协同作用.
肿瘤细胞的MDR是指肿瘤细胞对一种药物耐 药的同时，也对其他结构和作用机制不同的药物产生交叉耐药性.有研究表明，在敏感性低或产生MDR的癌细胞膜上存在一种P-gp，Mr 1.7×105 .P-gp能将已进入细胞内的化疗药物运出细胞外，从而降低细胞内药物浓度，是一种细胞膜上药物促排泵.VPM与细胞膜上的P-gp结合，有效地逆转P-gp药物促排泵作用，阻断MDR表达机制，使之化疗药物在细胞内浓度升高，细胞毒效应增强［19］ .钙与肿瘤细胞生长增殖密切相关，许多肿瘤细胞游离钙高于正常细胞，钙起到促有丝分裂原的作用，刺激细胞增生.VPM能阻滞钙离子从内质网中释放，抑制钙离子跨膜内流，阻止细胞内钙增加，妨碍钙和细胞内钙受体蛋白结合，具有钙拮抗作用.VPM使肿瘤细胞内的钙分布发生变化，从而改变了与肿瘤细胞分化和增殖密切相关的钙恒稳状态［20］ .利用FCM分析了细胞的动力周期，证明了化疗药与VPM合用后细胞增殖指数低于单用化疗药，S期数分数对照组为0.34，VPM+5-FU S期数分数为0.48，G2 /M为零，S期数分数高于对照组，说明药物使细胞阻滞在S期，抑制细胞有丝分裂.最终导致生长抑制，肿瘤细胞死亡.
本实验结果表明，以低剂量的化疗药物合并应用VPM获得单用高剂量的化疗药物相同疗效，从而减轻全身的毒副作用，这对肿瘤联合化疗具有实用价值，为VPM作为一种化疗增敏剂用于胃癌临床治疗提供理论依据.从实验结果表明VPM与5-FU，ADM合用对SGC-7901细胞增效作用显著，故作为胃癌联合化疗可能有更广阔前景.
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