关键词: 大鼠;肝硬化;一氧化氮合酶;免疫组织化学;Western blot
摘 要:目的 研究一氧化氮合酶亚型（NOS1 ，NOS2 ，NOS3 ）在肝硬化大鼠胃肠道中的表达，并探讨NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯（L-NAME）对其表达的影响. 方法 制作大鼠四氯化碳中毒肝硬化模型，肝硬化模型大鼠随机分为NO合酶（NOS）抑制剂治疗组和未治疗组，模型治疗组用L-NAME0.5mg・kg-1 ・d-1 ，胃内注入，每日1次，治疗10d.免疫组织化学染色显示胃肠道组织中各型NOS的染色强度和分布，Western blot法检测胃肠道组织中各型NOS的表达. 结果 模型组大鼠胃、小肠、结肠组织中的NOS染色强度显著弱于正常对照组和L-NAME治疗组大鼠.Western blot显示在肝硬化模型大鼠胃、小肠、结肠组织中的各型NOS表达均明显降低，L-NAME治疗后又恢复至接近正常. 结论 肝硬化大鼠胃肠道组织中各型NOS的表达明显减少，L-NAME对其表达有调节作用.
Keywords:rat;liver cirrhosis;nitric oxide synthase;im-munohistochemistry;Western blot
Abstract:AIM To investigate the effect of L-NAME on ex-pression of the nitric oxide synthase（NOS）isoforms in the cirrhotic rat intestine.METHODS Rats with cirrhosis in-duced by carbon tetrachloride were randomly pided into two groups，one receiving0.5mg・kg-1 ・d-1 of NG-nitro-L-arginine methyl ester（L-NAME）during10d，whereas the other group and control were administrated the same volume of saline.Immunohistochemical SABC method was used to observe the expression and distribution of three isoforms of NOS in gastrointestinal tract of rats.Western blotting was used to detect expression of gastrointestinal NOS isoforms.RESULTS NOS isoforms staining intensities were markedly lower in cirrhotic rat intestine than the control and cirrhotic rats after being treated with L-NAME.CONCLUSION Ex-pressions of the NOS isoforms were significantly reduced in the cirrhotic rat intestine.Maybe there is a regulation of L-NAME on expression of the gastrointestinal NOS isoforms in cirrhotic rats.
0 引言
NO作为一种神经递质和信使分子，具有多种生理功能，在神经传导和胃肠道功能调节中起重要作用［1-3］ .NO与肝硬化胃肠运动、粘膜分泌、粘膜免疫功能有密切的关系［4-6］ .我们应用NOS特异性抑制剂治疗肝硬化模型大鼠，观察其胃肠道NOS表达的变化，旨在探讨NOS在肝硬化大鼠胃肠道中的变化规律，为进一步研究NO在肝硬化胃肠道功能改变中的作用奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料
实验动物为雄性SD大鼠（本校实验动物中心提供），共36只，体质量（250±50）g，食用标准颗粒饲料，随机分为两组:模型组26只，正常对照组10只.按文献所述方法，制作四氯化碳（CCl4 ）中毒性肝硬化模型.模型组3mL・kg-1 CCl4 腹部皮下注射，每周2次，共12wk;正常对照组3mL・kg-1 体质量橄榄油腹部sc，每周2次，共12wk.12wk末，肝硬化模型建立后随机分为治疗组和未治疗组，另取同批正常SD大鼠作为对照组，每组10只.模型治疗组用NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯（L-NAME，Sigma产品），0.5mg・kg-1 ・d-1 ，ig;模型未治疗组和正常对照组用生理盐水灌胃，每日1次，均为10d.
1.2 方法
常规40g・L-1 多聚甲醛液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织改变.3组动物随机各取5只，10g・L-1 戊巴比妥钠50mL・kg-1 ，ip麻醉后，开胸行左心室插管，先用冷生理盐水灌洗，再以40g・L-1 多聚甲醛灌注固定1.5h，迅速取小部分胃、小肠、结肠组织，移至200g・L-1 蔗糖液浸泡24h（4℃下），至组织完全沉底，在-20℃下行冰冻切片，厚度有14～16μm（帖于载玻片上，37℃过夜）.用0.01mmol・L-1 PBS（pH7.4）洗5min×3，过氧化氢甲醇处理15min，PBS振洗5min×3，正常羊血清封闭30min后，加入兔抗NOS1 （1∶100，兔多抗），NOS2 （1∶100，兔多抗），NOS3 （1∶100，兔多抗）在4℃孵育过夜.PBS振洗5min×3，加入生物素化的羊抗兔IgG抗体，37℃30min.0.01mmol・L-1 PBS洗5min×3，滴加试剂SABC，37℃30min.0.01mmol・L-1 PBS洗5min×4，DAB显色（免疫组化试剂由武汉博士德生物工程有限公司提供）.苏木素复染后常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察并照相.
实验前12h禁食，不禁水.随机处死对照组、模型组和治疗组动物各3只，迅速剖腹分别取其胃，小肠和结肠，于冰盐水（含0.1mmol・L-1 PMSF）中清洗干净.立即液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存，此过程均在5min之内完成.配制三去污组织裂解液，去离子水配制，称量鼠胃肠组织，按每份组织加5份组织裂解液（m/V）的比例加入裂解液，于冰水中匀浆组织，3500r・min-1 ，5s×5，然后以10000g，离心10min，取上清分装贮存于-70℃备用于SDS-PAGE和Western blot分析，同时用Bradford法测定提取液中蛋白质浓度.灌制80g・L-1 的聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质样品加2×SDS上样缓冲液，加热100℃3min，再次离心后上样等量的蛋白质样品.20mA恒流电泳，结束后凝胶用考马斯亮蓝R250染色.同时各组鼠的胃，小肠和结肠蛋白质提取物用8g・L-1 SDS-PAGE进行分离，电泳结束后，用半干电转印仪（北京六一厂）将蛋白质电转印到硝酸纤维素膜上（转移缓冲液:25mmol・L-1 Tris-HCl，192mmol・L-1 甘氨酸，10g・L-1 SDS，20mL・L-1 甲醇，pH8.3）.0.8mA・cm-2 恒流转印1h，TBS pH7.5+50g・L-1 脱脂奶粉+0.5g・L-1 NP-40室温下封闭2h，用含0.1g・L-1 BSA的TBS缓冲液稀释兔抗NOS1 （1∶100，兔多抗），NOS2 （1∶100，兔多抗），NOS3 （1∶100，兔多抗），4℃孵育16～18h，TBS洗10min×3，TBS稀释HRP标记的羊抗兔（1∶400，博士德公司产品）二抗室温作用2h，TBS+1g・L-1 NP-40洗10min×5，DAB显色.
2 结果
模型大鼠肝、脾肿大，肝脏质地变硬，边缘钝，表面不光滑，有大小不等的小结节，光镜示肝细胞再生，脂肪变性，胶原纤维组织增生，有明显的假小叶形成.
2.1 胃肠道组织内NOS
NOS免疫组织化学染色 显示，NOS1 ，NOS2 和NOS3 在胃肠道粘膜固有层有相似的分布，主要存在于胃肠道粘膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOS1 还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，NOS2 存在于粘膜下层血管内皮细胞.正常大鼠胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层下1/3，小肠在绒毛间质中，结肠则散在于粘膜绒毛间质中，上皮细胞均为阴性.而肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数明显减少，胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层基底部.用L-NAME治疗的肝硬化大鼠胃肠组织中NOS阳性细胞数和神经丛中NOS染色强度明显强于肝硬化模型未治疗组（Fig1）.
2.2 SDS┐PAGE和Western blot检测
SDS-PAGE显示各组大鼠胃，小肠和结肠的全层组织蛋白质构成比例是不同的，小肠组织中低分子量的蛋白质较多.而在不同组大鼠的同一组织中蛋白质构成比例却无明显差别（Fig2）.Western blot显示肝硬化组大鼠胃，小肠和结肠组织中各型NOS的表达均是降低的.肝硬化大鼠经L-NAME治疗后胃肠道各段NOS表达又有所增加.但各组大鼠小肠中均未检测出NOS1 和NOS3 ，肝硬化大鼠小肠中甚至未检测出NOS2 （Fig3A～D）.
3 讨论
NOS是NO合成的关键限速酶，广泛存在全胃肠道组织中，根据NOS生物学特性和编码基因不同可分3型.神经元型nNOS（NOSⅠ），内皮型eNOS（NOSⅢ）和诱生型iNOS（NOSⅡ），它们之间有50%的同源性.NOSⅠ主要存在于神经细胞和上皮细胞;NOSⅡ最初是从巨噬细胞分离出来的，后来发现他们也存在于其他细胞，如血管平滑肌细胞;NOSⅢ主要存在于血管内皮细胞.根据NOS酶活性对Ca2+ /CaM的依赖性不同将NOS分为2类，一类是构建型NOS（cNOS），NOSⅠ和NOSⅢ都属于此类， 其活性受Ca2+ /CaM的调控，使NO的释放呈间歇、脉冲式发挥对机体的保护作用.cNOS主要存在于正常血管内皮细胞，亦存在于肾上腺、血小板、成纤维细胞、PMN、脑以及某些非胆碱能非肾上腺素能神经末稍.另一类是诱生型NOS（iNOS），NOSⅡ属于此类，其酶活性不依赖于Ca2+ /CaM，但需要有诱导因子的存在. iNOS主要存在于内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、肥大细胞和肾基底膜细胞等［7-11］ .在某些病况下，胃肠道组织中NOS表达不同.腹腔炎性病时，小肠壁内iNOS阳性细胞主要分布在粘膜固有层，80%以上为CD45阳性的各类炎性细胞，约15%为CD3阳性的T淋巴细胞，而上皮细胞均为阴性［12］ ;溃疡性结肠炎时，iNOS阳性细胞主要分布在肠上皮细胞，粘膜固有层细胞均为阴性［13］ ，肝硬化时尚不清楚.
我们的研究显示，NOS1 ，NOS2 和NOS3 在胃肠道粘膜固有层有相似的分布，主要存在于胃肠道粘膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOS1 还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，NOS2 存在于粘膜下层血管内皮细胞.正常大鼠胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层下1/3，小肠在绒毛间质中，结肠则散在于粘膜绒毛间质中，上皮细胞均为阴性.而肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数明显减少，胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层基底部.用L-NAME治疗的肝硬化大鼠胃肠组织中NOS阳性细胞数和神经丛中NOS染色强度明显强于肝硬化模型未治疗组.提示肝硬化时大鼠胃肠道各段NOS表达减少，而L-NAME灌胃治疗10d后胃肠道各段NOS表达又有所增加.我们用Western blot方法检测了各组大鼠胃，小肠和结肠的全层组织中各型NOS的表达，表明与NOS免疫组织化学染色一致，因而表明肝硬化大鼠胃肠道各段NOS（cNOS和iNOS）表达是降低的.L-NAME是NOS的特异性拮抗剂，可抑制NOS的活性，减少NO的合成.文献及我们以往的研究显示肝硬化患者及大鼠血清中NO的水平是升高的，用L-NAME治疗后血清中NO的水平下降，而我们的NOS免疫组织化学染色及Western blot结果却显示肝硬化大鼠经L-NAME治疗后胃肠道各段NOS表达又有所增加，提示肝硬化时大鼠胃肠道各段NOS的表达可能受到血清及门脉中NO水平的反馈调节.
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