关键词 :氮;低温保藏;主动脉瓣;细胞存活;细胞增殖能力;组织培养
摘 要:目的 主要观察液氮（-196℃）保存1～24mo不同时间段的瓣膜组织细胞活力及组织培养细胞生长情况的变化，为临床适用的人同种主动脉瓣的适宜保存期限提供实验依据. 方法 选取（18～35）岁健康成年男性脑死亡30min内取材的主动脉瓣膜20个.依据保存时间分为10组，Ⅰ组为新鲜对照组，取材后直接供实验用，Ⅱ～Ⅹ组为冷冻保存组，分别为冷冻保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo的瓣膜，每组2个瓣膜共6个瓣叶.冷冻保存组各组瓣膜缓慢降温（1℃・min-1 ），液氮中保存，实验时进行快速复温.瓣叶剪为细小组织块，一半置入培养瓶中做组织培养，相差显微镜下观察其组织细胞生长情况;另一半组织块用胰酶消化，光镜下做细胞计数并计算其细胞活力. 结果 Ⅰ组的组织细胞活力最高（93.8%），Ⅱ～Ⅹ组细胞活力均较Ⅰ组明显减低（67.3%vs93.8%P&<0.05）;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ组细胞活力较Ⅱ～Ⅶ组瓣膜各组明显减低（52.4%vs76.5%P&<0.05）.Ⅰ组组织细胞1wk镜下可见，生长较快，4wk时镜下细胞数较多;Ⅱ～Ⅶ组组织细胞2wk镜下可见，生长较Ⅰ组稍缓慢，4wk时镜下细胞数减少;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ组细胞3wk镜下可见，生长较慢，4wk时镜下细胞数较Ⅰ组明显减少. 结论 液氮保存对人同种瓣膜组织细胞活力有显著影响，其程度随保存时间增长而加重;液氮保存1～15mo瓣膜组织细胞生长较新鲜瓣膜组稍晚，但组织细胞活力仍较高;液氮保存18～24mo瓣膜组织细胞活力明显减低，组织细胞生长缓慢，因此瓣膜组织活性及瓣膜耐久性可能减低.据此可认为，人同种主动脉瓣的适宜保存期限为15mo以内.
Keywords:nitrogen;cryopreservation;aortic valve;cell sur-vival;cell proliferative capacity;tissue culture
Abstract:AIM To observe the cellular viability and cell proliferative capacity of human aortic valves cryopreserved in liquid nitrogen at-196℃.METHODS Twenty valves，procured from18to35years old healthy adult hearts within30min after the determination of brain death，were pided into10groups.GroupⅠ，the control group，is of fresh valves.Valves from GroupⅡto GroupⅩwere those pre-served in liquid nitrogen for1，3，6，9，12，15，18，21，24mo respectively.The fresh valves were examined immediately after procurement.All the cryopreserved valves were thawed in37℃saline pool.Each specimen was cut into pieces of1mm×1mm×1mm.Half of the tissues were reduced with3.5g・L-1 trypsin and dyed with trypan blue，then the num-ber of viable and nonviable cells were counted.The remaining tissues were incubated in RPMI1640medium containing100mL・L-1 fetal calf serum at37℃to observe the capacity of cell proliferation on the7th and28th day.RESULTS Fresh valves seemed to have the highest cell survival rate of all the groups（93.8%）.In cryopreservation groups，there was a tendency that the longer the duration of preservation was，the lower the survival rate was.Valves from GroupⅡto GroupⅩshowed a significant decrease in cell survival rate compared with those from GroupⅠ（67.3%vs93.8%P&<0.05）.Valves from GroupⅧ，ⅨandⅩshowed a signifi-cant decrease in cell survival rate compared with those from GroupⅠto GroupⅦ（52.4%vs76.5%P&<0.05）.Cells in GroupⅠgrew out of the tissue pieces during the first week and fully covered the bottom of culture container during the fourth week.In the middle of the second week，however，cells of GroupⅡto GroupⅦstarted to appear at the edge of the tissues and occupied the most part of the container bot-tom.In GroupⅧ，ⅨandⅩ，cells were scarcely seen during the first week and the cell number was markedly decreased during the fourth week compared with that of the fresh valves.CONCLUSION Cryopreservation in liquid nitrogen has significant effects on the cellular viability and cell prolif-erative capacity of human aortic valve tissues.Valves that are preserved for18or more months have lower cellular survival rates and show a dramatic decrease in cellular capacity of pro-liferation.According to the results of our experiments，the durability of valves cryopreserved18or more months would decrease correspondingly.
0 引言
20世纪60年代初，Ross［1］ 首次成功地将人同种主动脉瓣原位移植于人体，经过近40a临床技术和瓣膜保存方法的不断改进［2］ ，国内外有关活性同种异体主动脉瓣的研究不断发展［3］ ，同种生物瓣的研究和应用取得了很大进步［4］ .人同种带瓣管道具有中心血流、抗钙化及抗血栓形成且无需术后长期抗凝治疗等优点［5］ ，从而在临床应用上显示出其他瓣膜无可比拟的优越性及应用前景［6］ .尽管临床上瓣膜的应用历史比较早，但国内外对于同种瓣膜的组织活性与冷冻保存时间的相关性研究尚少见报道［7］ .本研究目的在于通过对瓣膜组织活性的量化，探讨适宜的瓣膜保存期限，为临床应用同种异体瓣提供可靠的实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料
选用（18～35）岁健康成年男性脑死亡30min内取材的主动脉瓣20个.供体心脏均在脑死亡后30min内无菌取出，剪开心脏四腔，4℃生理盐水冲洗3次，用3层无菌塑料袋盛入供心并逐层线扎，冰壶带回，在无菌台上修剪成带瓣管道.实验分为新鲜瓣膜对照组（Ⅰ组）和冷冻保存组（Ⅱ～Ⅹ组）.对照组取材后不入液氮内保存，瓣叶剪下后直接供实验用.冷冻保存组依据在液氮（（196℃）中保存时间分为Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ组，分别为冷冻保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo的瓣膜.每组2个瓣膜共6个瓣叶.
1.2 方法
修剪备用的带瓣主动脉管道浸入含低浓度抗生素和二甲基亚砜（DMSO）的RPMI1640营养液中，3层无菌耐低温塑料袋分别束扎，外裹锡箔袋，标记时间后，置入4℃冰箱中2h，再置入液氮蒸气中使瓣膜缓慢降温，最后放入液氮中长期保存，降温速率保持在1℃・min-1 左右.定期添加液氮，使瓣膜始 终保持在-196℃.实验当日取保存不同时间的带瓣管道在37℃水浴箱中快速复温5min，然后掀去包裹薄膜，再在37℃无菌生理盐水中快速复温，复温中不断轻柔翻动带瓣管道，使其各部位的温度均匀上升.新鲜组瓣膜及冷冻复温后各组瓣膜均在超净工作台上无菌取出，剪切瓣叶并观察其大体形态，分切瓣叶并切成1mm×1mm×1mm组织碎块做以下实验分析.
1.2.1 瓣膜细胞活力测定
组织碎块置入2.5g・L-1 胰蛋白酶溶液在室温下消化2～3h，200目钢网过滤，滤液经1500r・min-1 离心10min，去上清液，加入少量营养液终止消化，1500r・min -1 离心10min，去上清液，制备成5×106左右的细胞悬液，加入20g・L-1 胎盼蓝，滴入血细胞计数器，光镜下计数四个大格内的着色细胞和拒染细胞即活细胞，根据下式计算细胞活力:细胞活力=［拒染细胞数/（着色细胞数+拒染细胞数）］×100%
1.2.2 组织培养观察
各组瓣膜组织碎块置入25mL培养瓶内，待组织块贴壁后，加入少量含100mL・L-1 胎牛血清（FCS）的RPMI1640营养液中，在37℃含50mL・L-1 二氧化碳培养箱中孵育72h，观察组织生长情况并追加少量营养液.以后每3d更换营养液一次，培养后3，7，10，14，17，21，24和28d在倒置光相差显微镜下观察并摄像记录.
统计学处理:瓣膜细胞活力测定结果以（x ±s%）表示，用SigmaStat2.0统计软件包处理，冷冻保存组各组与新鲜瓣膜组组间数据行t检验，P&<0.05为有显著性差异.
2 结果
2.1 瓣膜细胞活力
Ⅰ组瓣膜细胞活力最大，为93.85%.Ⅱ～Ⅹ组细胞活力均较Ⅰ组减低（P&<0.05），且随保存时间加长而逐渐减低;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ各组的细胞活力与Ⅰ组及Ⅱ～Ⅶ组相比明显减低（P&<0.05，Tab1）.表1 新鲜瓣膜组与冷冻保存瓣膜组的细胞活力对比（略）
2.2 组织培养
Ⅰ组组织培养1wk时细胞从组织块边缘开始移行，细胞增殖较快，细胞数目较多，4wk时镜下细胞占满培养瓶壁;Ⅱ～Ⅶ组瓣膜组织细胞移行较新鲜瓣膜组稍晚，约1～2wk时间，细胞增 殖稍慢，细胞数目仍较多，4wk时镜下细胞数较多;Ⅷ～Ⅹ组瓣膜组织细胞在2wk后开始移行，细胞增殖较慢，细胞数目较少，4wk时镜下细胞数较Ⅰ组明显减少（Fig1～6）.
3 讨论
人同种主动脉瓣具有中心血流、抗钙化及抗血栓形成且无需术后长期抗凝治疗等优点，从而在临床应用上显示出其他瓣膜无可比拟的优越性及应用前景.
临床资料表明，人活性同种主动脉瓣的耐久性（dura-bility）优于无活性瓣膜［8］ .1962年，Ross首先在临床上将人同种主动脉瓣（human aortic valve homo-graft，HAVH）原位置换成功.同年Barratt-Boyes［9］ 报道了44例HAVH置换的成功经验，但这些瓣膜活性丧失，瓣膜10a衰坏率较高.1960年代后期，临床采用4℃营养液保存的HAVH，其组织细胞在保存液中可存活1wk，瓣膜寿命延长，衰坏率降低.1970年代后期，O’Brien等［10］ 采用液氮保存的HAVH（cry-opreserved aortic valve homograft，CAVH），行主动脉置换术192例，发现瓣膜耐久性明显提高，10a衰坏率为零;同时发现CAVH植入宿主体内9a3mo，经细胞培养证明供体瓣纤维细胞能在宿主体内长期存活，并提出纤维细胞存活的同种活细胞瓣膜（viable aortic valve homograft，VAVH）的概念.VAVH具有良好的血流动力学、较强的抗感染、抗血栓作用且无需抗凝治疗，它的抗张强度较无活性瓣膜大为提高，所有上述功能的优越性都基于瓣膜组织良好的结构完整性，包括纤维细胞功能代谢正常及纤维支架的形态结构较完整等.HAVH的采集、灭菌处理、保存方法等均可影响瓣膜活性和组织代谢［11］ .采集时主要考虑二种因素的影响:供体的年龄和热缺血时间（warm ischemia time，WIT）.供体选择健康成年人，年龄多在20～35岁.有资料表明，超过45岁的供体临床使用后易发生瓣膜蜕变、钙化和关闭不全.供体在心腔冷灌前主要为热缺血损伤，随WIT延长，组织细胞可发生胞质水肿、内质网扩张、线粒体肿胀等可逆性损伤，随WIT不断增加，细胞可产生线粒体絮状沉积、核膜溶解、核染色质丢失、细胞裂解等不可逆性损伤［12］ ，最终导致细胞死亡，因此应尽量缩短WIT.本研究中WIT控制在30min内，及时对供体心腔用4℃生理盐水冷灌冲洗，尽快清除残留在心腔及瓣膜上的血块，有效地降低了瓣膜组织温度，使瓣膜组织细胞代谢减慢，从而减低组织细胞因缺血缺氧产生的损伤.HAVH采集后应及时进行灭菌处理.瓣膜应用早期，灭菌时使用毒性较大的化学物质或以高能电子射线照射，组织抗张强度差，瓣膜耐久性差，已不再使用.目前瓣膜灭菌普遍采用低浓度抗生素灭菌法，这种方法能较好地保存组织活细胞［13］ .我们采用的HAVH处理和灭菌方法源于美国盐湖城的L.D.S医院［14］ ，并把保存液中的小牛血清含量提高5%，经此方法处理和冷冻保存的瓣膜临床应用效果良好［15］ .瓣膜在降温过程中加用适宜浓度的冷冻保护剂（甘油、DMSO等），可有效地减少冷冻损伤［16］ .冷冻降、复温对瓣膜组织结构，特别是内皮细胞影响较大.采用快速降温（10～100℃・min-1 ）时，细胞质、细胞核和染色体内均有冰晶形成，细胞膜结构易于破裂;温度骤降使细胞内酶变性导致低温休克（thermal shock）对细胞的损害作用更甚于冰冻的机械作用
［17］ .本实验证明，缓慢降温对组织的破坏较轻，而采用1℃・min-1 降温效果最佳，这与有些报道结果相同.在不同的降温速率，DMSO对组织细胞的 影响也不同，1℃・min-1 降温时DMSO的适宜浓度为100g・L-1 .复温常采用37～42℃水溶液中快速复温［18］ ，以减少组织过冰点时细胞再结晶的形成.我们在快速复温过程中，采用37℃恒温水浴箱复温，水温始终保持于37℃左右，并快速解除包裹塑料膜，再在无菌溶液中梯度融解，冷冻保护剂得到及时稀释，从而维持了组织细胞内外渗透压的平衡，组织破坏较轻，并在顺梯度浓度稀释时加用适量营养液，从而最大可能地保留了瓣膜组织活细胞. 转贴于 瓣膜组织观察的指标有组织结构、组织活性、细胞增殖能力、代谢功能、细胞特异性抗原鉴定等，其中组织活性和细胞增殖能力是反映瓣膜是否具有活性的两个重要指标［19］ .活性是指细胞或组织维持自身和与外界能进行正常交换的能力［20］ ，组织活性主要观测细胞活力，包括内皮细胞和纤维细胞的活力;细胞增殖能力则主要观察组织细胞培养后的生长情况.细胞活力测定可定量反映瓣膜组织细胞存活程度.从实验结果可以看出，新鲜瓣膜的细胞活力最高，且细胞增殖能力较高，说明新鲜瓣膜最大限度地保留了组织活细胞，组织结构较完整，细胞增殖活跃.液氮保存的瓣膜组织细胞活力均较新鲜瓣膜显著减低，说明液氮保存1mo的瓣膜组织细胞即出现损伤情况，且其程度与瓣膜冷冻保存时间呈正相关关系，冷冻保存时间愈长，瓣膜组织细胞损伤愈重，组织细胞存活率愈低.理论上认为，液氮保存时组织代谢接近停止，瓣膜活细胞可长期保存，但瓣膜组织代谢虽处于低水平，却没有完全停止，细胞仍处于缓慢的无氧代谢过程，细胞内外可能仍有离子交换及渗透压的改变，随保存时间延长，细胞内外代谢产物不断积累，以及冷冻降温过程中各种物质浓度积累到有害程度，可导致细胞完整性的破坏，从而使细胞受到损伤.液氮保存1～15mo瓣膜组织活细胞在60%以上，组织培养后的细胞生长情况较好，证明液氮保存1～15mo的瓣膜组织保留大部分的组织活细胞，且细胞增殖能力仍在较高水平，瓣膜组织活性较高.而液氮保存18～24mo瓣膜组织活细胞在50%或以下，且细胞增殖能力较差，虽然保留了部分组织活细胞，但从整体上看，瓣膜组织活性较低，因此临床应用价值较小.综上所述，液氮保存可影响瓣膜的组织代谢和活性，其程度随保存时间延长而逐渐加重.结合形态学及相关资料可以认为，液氮保存1～15mo瓣膜组织活性仍较高，瓣膜组织代谢相对处于较高水平，临床应用价值较大;而液氮保存18～24mo瓣膜组织活性明显减低，瓣膜组织代谢相对处于较低水平，瓣膜活性较差，其临床耐久性可能减小.因此可认为，人同种主动脉瓣膜保存期限以15mo以内为宜.
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